桂枝芍药知母汤缓解类风湿关节炎的网络调控机制研究

谢健，谭丽雯，江福能，钟惟德，梁宇翔

(广州市第一人民医院，广东 广州 510180)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性系统性自身免疫性疾病[1]。RA病程中综合体现了滑膜增生、炎症、自身免疫、内分泌紊乱等多种病理生理过程，它们相互关联、相互作用，形成一个错综复杂的网络。

桂枝芍药知母汤(GuiZhi Shaoyao Zhimu Decoction，GSZD)出自《金匮要略·中风历节病脉证并治第五》，由9味中药组成，包括桂枝、白芍、甘草、麻黄、生姜、白术、知母、防风、附子，具有祛风除湿、温经散寒、滋阴清热之功效，主要用于治疗风寒湿痹日久、渐次化热伤阴之证[2]。GSZD具有寒温并用、温散而不伤阴、养阴而不碍阳的特点，是古今医家治疗风湿历节的常用方[3]。

已有临床研究表明GSZD具有减轻炎症活动、抑制免疫、改善微循环作用，产生减轻关节肿胀、疼痛的功效，对RA患者的整体调节具有重要作用[4]。然而，其对人体免疫功能、致炎因子等方面的作用机制尚不明确。因此，本研究拟采用网络药理学方法，预测该方缓解RA的作用靶标，并通过网络拓扑特征计算，阐释该方的配伍规律，揭示其对RA疾病网络的干预机制。

1 材料

1.1 GSZD化学成分数据集的建立

基于中医药百科全书数据库(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM，http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/，version 1.0)[5]，收集GSZD所含中药的化学成分信息，建立GSZD的化学成分数据集。

1.2 GSZD候选靶标谱的预测

在ETCM的Target子库中，检索GSZD所含化学成分的候选靶标谱。ETCM采用MACCS(Molecular ACCess System)分子指纹，使用开源软件OpenBabel来进行化学指纹特征的提取，并采用Tanimoto系数定义的相似度计量方法，通过与FDA上市药物进行相似性打分(Score≥0.8)，并提取作用靶标[5]。

1.3 已知RA治疗靶标谱的收集

基于DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca/，version 5.1.2，released 2018-12-20)[6]，利用关键词“rheumatoid arthritis”，收集已知用于RA治疗的药物信息，并汇总其靶标基因信息。

2 方法

2.1 “GSZD候选靶标-已知RA治疗靶标”相互作用网络构建与分析

基于String数据库(https://string-db.org/，Version：10.5)[7]，收集GSZD候选靶标和已知RA治疗靶标的相互作用信息，并采用Cytoscape软件进行网络可视化和计算网络特征值，包括节点连接度(degree)、节点紧密度(closeness)和节点介度(betweenness)。以“节点连接度(degree)”的2倍中位数为卡值，选取“GSZD候选靶标-已知RA治疗靶标”相互作用网络的核心节点(hubs)；在此基础上，建立核心节点的直接相互作用网络，并计算节点连接度(degree)、节点紧密度(closeness)和节点介度(betweenness)等3个拓扑结构特征值，选择3个拓扑特征值均大于相应中位数的节点作为GSZD缓解RA的关键网络靶标。

2.2 基因功能和通路富集分析

基于本体数据库(Gene Ontology，GO)和KEGG 通路数据库[8]，采用The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery(DAVID，https://david.ncifcrf.gov/，v6.8)的分析平台[9]，针对GSZD缓解RA的关键网络靶标参与的生物学功能和通路，开展富集分析。

3 结果

3.1 GSZD所含的化学成分及其候选靶标谱

通过ETCM数据库，共收集GSZD所含9味中药的509个化学成分，其中，白芍57个，白术33个，防风33个，附子40个，甘草134个，桂枝13个，麻黄29个，生姜128个，知母42个。基于上述化学成分的结构信息，共预测获得GSZD的候选作用靶标718个。如图1所示，GSZD的候选靶标主要参与血管新生通路(如VEGF signaling pathway、Cardiac muscle contraction、Vascular smooth muscle contraction)、免疫炎症调节通路(如Steroid hormone biosynthesis、Steroid biosynthesis、Fc epsilon RI signaling pathway、B cell receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway)、破骨细胞分化通路(如，Osteoclast differentiation)以及能量和药物代谢相关通路(如Caffeine metabolism、Retinol metabolism、Linoleic acid metabolism、Nitrogen metabolism、Bile secretion、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、Drug metabolism、Ascorbate and aldarate metabolism、Carbohydrate digestion and absorption、Drug metabolism、Arachidonic acid metabolism、Pentose and glucuronate interconversions、alpha-Linolenic acid metabolism)。

图1GSZD候选靶标显著富集的GO功能和KEGG通路统计图

Figure1GO function and KEGG pathway statistical map with significant enrichment of GSZD candidate targets

3.2 GSZD缓解RA的关键网络靶标

基于GSZD候选靶标与已知RA治疗靶标之间的相互作用信息，建立“GSZD候选靶标-已知RA治疗靶标”互作网络，包含519个节点和3 131条边。以2倍节点连接度中位数作为卡值，筛选得到113个hub节点。进而构建hub节点的直接相互作用网络，包含113个hub节点和1 248条边。通过hub节点的节点连接度(degree)、节点紧密度(closeness)和节点介度(betweenness)中位数卡值筛选，获得45个关键网络靶标，其网络拓扑特征值见表1。

表1 GSZD缓解RA关键网络靶标拓扑特征值列表

Table1Topological eigenvalue list of key network targets for GSZD mitigation of RA

基因名称连接度紧密度介度AKT1290.520 930 230.020 207 91ALB330.574 358 970.051 202 05CALM1230.504 504 50.023 469 87CALM2220.502 242 150.015 113 54HSP90AA1200.464 730 290.015 203 12INS340.586 387 430.051 813 5NR3C1200.523 364 490.014 653 9APP280.506 787 330.057 757 1GPER230.476 595 740.024 909 96POMC300.516 129 030.081 662 44AKR1C3260.478 632 480.005 681 16CYP1A1460.533 333 330.027 581 99CYP2E1380.541 062 80.022 683 52CYP3A4470.562 814 070.036 820 6HSD3B1260.506 787 330.020 376 79HSD3B2250.50.019 607 53UGT1A1390.486 956 520.008 647 97UGT1A10350.476 595 740.004 413 22UGT1A4350.476 595 740.004 413 22UGT1A6400.541 062 80.033 945 27UGT1A8350.476 595 740.004 413 22UGT1A9390.497 777 780.016 309 5AR200.50.013 875 13CYP19A1230.528 301 890.027 308 5CYP1A2410.511 415 530.012 177 32CYP3A5360.489 082 970.005 404 65HPGDS320.583 333 330.064 149 11ESR1220.554 455 450.016 219 17IL1B250.489 082 970.012 959 18IL2210.470 588 240.006 145 72PIK3CA250.489 082 970.009 277 02CYP2C9380.523 364 490.013 608 02CYP2B6410.557 213 930.037 558 97CYP2C8360.518 518 520.012 570 75CYP4A11360.518 518 520.018 361 68FOS300.568 527 920.042 487 61JUN320.580 310 880.040 962 01

表1 (续)

根据生物学功能和通路富集结果显示(图2和表2)，GSZD缓解RA的关键网络靶标主要参与代谢类通路(如Drug metabolism-cytochrome P450，Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450，Retinol metabolism，Arachidonic acid metabolism，Drug metabolism-other enzymes，Ascorbate and aldarate metabolism，Metabolic pathways，Linoleic acid metabolism，Pentose and glucuronate interconversions，Porphyrin and chlorophyll metabolism)、免疫-炎症调节通路(如Steroid hormone biosynthesis，TNF signaling pathway，T cell receptor signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，Inflammatory mediator regulation of TRP channels，Fc epsilon RI signaling pathway，B cell receptor signaling pathway)、骨破坏相关通路(如Osteoclast differentiation)和血管新生相关通路(如VEGF signaling pathway)。

注：红色标注节点为GSZD缓解RA关键网络靶标。

图2GSZD缓解RA关键网络靶标互作网络及其主要参与通路图

Figure2Interaction network and main participation path diagram of key network targets for GSZD mitigation of RA

表2 GSZD缓解RA关键网络靶标的功能和通路富集列表Table 2 Functional and pathway enrichment list of GSZD mitigating RA key network targets

表2 (续)

4 讨论

网络药理学对“疾病-表型-基因-药物”的多层次信息进行融合，从系统和网络的角度理解疾病表型与生命大分子的关系，在其对“疾病表型-生物分子”网络构建的思路指导下进行中医药证候生物学基础的研究已经取得一定的进展[10]。从中医药“整体观念”切入，采用“网络药理学”研究策略，按照“中药化学成分收集—成分靶标预测—靶标互作网络挖掘”的技术路线，通过分析中药靶标与疾病相关基因和通路之间的关联性，揭示中药的作用机制，有助于适应并体现中药多成分、多靶点、协同作用的特点，并为方证研究和新药开发提供全新的选择与向导[11]。

RA是一种慢性、系统性、自身免疫性疾病，主要病理表现为对称性、多发性关节炎症[1]。除关节病变外，RA还可引起多种关节外病变，包括心血管系统、内分泌系统、血液系统、神经系统疾病等，因而又称为病谱性疾病[12]。在RA进展过程中，往往出现滑膜增生、炎症、自身免疫、内分泌紊乱等多种病理生理表现，各个病理环节的相关基因之间形成错综复杂的相互作用网络。

作为古今医家治疗风湿历节的常用方剂，GSZD具有寒温并用、温散而不伤阴，养阴而不碍阳的特点[3]。现代临床研究和药理学研究表明，GSZD可通过减轻炎症活动、抑制免疫、改善微循环等作用，发挥其减轻关节肿胀和疼痛及调节机体免疫功能的疗效[13]。Guo等[14]研究发现，GSZD具有改善RA病情、减轻RA症状的作用，其作用机制可能是通过调控HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF信号轴来矫正RA进展相关的“炎症-免疫失衡网络”。为进一步探明GSZD治疗RA的作用机制，本研究整合药物靶标预测、网络分析和功能富集，旨在发现该方抗RA的关键网络靶标，并深入挖掘其机制。通路富集结果表明，GSZD缓解RA的关键网络靶标主要参与4种类型的信号通路：药物代谢相关、炎症-免疫相关、破骨细胞分化和血管新生信号通路。

本研究结果表明，GSZD 抗 RA作用可能是通过逆转炎症-免疫系统的失衡、调节机体代谢、缓解骨破坏和抑制血管新生而实现。相关研究结果为GSZD抗RA的作用机制探索提供新靶点、新通路，为进一步验证性研究提供了理论依据。