三氧膏体外抗真菌作用及临床疗效观察

李爱国，李玲梅，张欣婷，刘力，王伟

(广州中医药大学祈福医院，广东 广州 511495)

近年来，由于环境污染、食品添加剂的滥用导致免疫受损人群不断增多，加之家庭饲养宠物的风行等，使得真菌病发病率呈现逐年上升趋势。浅部感染真菌主要分为小孢子菌属、表皮癣菌属和毛癣菌属，大约有40多种皮肤癣菌，其中白色念珠菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌和石膏样小孢子菌为常见致病菌株[1]。目前，临床上常用抗真菌感染药物主要有多烯类抗生素、氨基甲酸酯类和咪唑类等；但是，其对人体均有不同程度的毒副作用，同时由于使用不规范、滥用等问题，导致耐药性日益严重，迫切需要寻找安全有效的新抗真菌药物[2]。

三氧(即臭氧)是一种常温下有特殊臭味的淡蓝色气体，被称为21世纪的气体分子药物，具有强氧化作用；高纯度医用三氧对细菌、病毒、真菌等多种病原微生物均可起杀灭作用，具有“绿色”杀菌的特点；同时还能促进清除氧自由基，减轻关节滑膜及周围组织炎症[3]。现已广泛应用于公共卫生和日常生活中，在欧洲已有近百年的使用历史[4]。本院采用独家发明专利技术[5]，利用臭氧发生器，将三氧溶解于紫草油中，进而制备成复方中药软膏剂——三氧膏，提高其稳定性、方便携带和涂抹、提高患者的顺应性，而且其透皮性能好，有利于三氧渗透发挥抗菌作用。为了验证三氧膏的抗真菌效果，本实验以白色念珠菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌和石膏样小孢子菌等临床常见致病真菌为研究对象，以抑菌环直径及最低抑菌浓度为指标，评价其体外抗真菌作用。同时，以临床常用酮康唑为对照，应用三氧膏通过涂抹方式治疗足癣患者，评价其治疗效果，为其临床的进一步应用及推广提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试药 酮康唑乳膏(西安杨森制药有限公司，批号：170622856，质量分数：2%)；紫草膏(武汉建民集团随州药业有限公司，批号：1705067，质量分数：35.71%)；三氧膏(广东祈福医院有限公司自制，批号：20180509，质量分数:0.84%)；二甲基亚砜(Sigma公司)；琼脂粉、马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、沙堡弱培养基(SDA)、M-H琼脂、燕麦培养基、RPMI-1640培养基(广东环凯微生物科技有限公司)。

1.1.2 菌株 白色念珠菌(Canidiaalbicans，SC 5314)，中山大学附属口腔医院提供；须癣毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes，NBRC 6202)、红色毛癣菌(Trichophytonrubrum，ATCC MYA-4438)和石膏样小孢子菌(Microsporum，gypseum，ATCC 14683)，广东省微生物菌种保藏中心提供。

1.1.3 主要仪器 LI20-2细菌培养箱(美国Shellab)；Infinite 200 PRO酶标仪(瑞士Tecan)；万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo)；SG-404SG-604生物安全柜(美国Baker)；DVM6显微镜(德国Leica)；DendiCHEK plus电子比浊仪(生物梅里埃美国股份有限公司)；YXQ-LS-50SII高压灭菌器(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 体外抗真菌活性测定[6]

1.2.1.1 培养基配制 马铃薯葡萄糖培养基、沙堡弱培养基、M-H琼脂和燕麦培养基等按处方说明称取，倒入三角瓶中，加入一定量的蒸馏水，搅匀封口，高压灭菌(121 ℃，30 min)，灭菌后分别倒入一次性平板，冷藏备用。

1.2.1.2 真菌的复苏、培养和菌悬液的制备 ①将白色念珠菌用SDA活化，35 ℃培养24 h，用无菌拭子挑取单个菌落加入无菌生理盐水，采用电子比浊仪调节菌液浊度至0.5个麦氏浊度，相当于1～5×106CFU/ mL。②分别将须癣毛癣菌和石膏样小孢子菌用PDA平板、红色毛癣菌用燕麦培养基进行活化诱导产孢，30 ℃培养7 d，用无菌拭子刮取平板表面孢子加入无菌生理盐水中，采用电子比浊仪调节菌液浊度至0.5个麦氏浊度。③分别将上面的菌悬液稀释1 000倍作为MIC测定的菌悬液备用。

1.2.1.3 抑菌圈直径测定(纸片法) 分别称取一定量的三氧膏、紫草膏和酮康唑乳膏，制备成含药量为0.5 mg的药敏片，另以乳膏基质为空白参照；吸取白色念珠菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌和石膏样小孢子菌的菌悬液各0.1 mL，分别均匀涂布于M-H琼脂平板上，放置3～5 min，再将3种药敏片及空白药敏片等距离(纸片间间距大于24 mm)贴放于含菌琼脂板上，倒置于培养箱中，白色念珠菌30 ℃培养24 h，其他菌30 ℃培养72 h后测量抑菌圈，重复3次试验；用游标卡尺测量抑菌圈直径，取平均值。结果判定：比较抑菌圈直径大小，越大则表示越敏感。

1.2.1.4 最低抑菌浓度(MIC)测定 分别称取一定量的三氧膏、紫草膏和酮康唑乳膏，用10%二甲基亚砜溶解配成0.48 mg/mL原液。根据二倍稀释法将原液用RPMI-1640液体培养基稀释成浓度为240、120、60、30、15、7.5、3.75、1.88、0.94、0.47、0.24 μg/mL的系列溶液。吸取系列不同浓度药液和菌悬液各100 μL于96孔板第1～11孔中，第12孔加入配制溶剂和菌悬液各100 μL作阴性对照；同时，另设“药液+液体培养基”为对照以消除每孔药物稀释后存在颜色和浑浊度差异；置培养箱中，白色念珠菌35 ℃培养48 h，其他菌30 ℃培养96 h。将96孔板置于酶标分析仪中，于波长600 nm处测各孔吸光度(A)值。与阴性对照孔相比，以A值下降80%以上者为该药物的最低抑菌浓度(MIC值)。

1.2.2 临床疗效观察

1.2.2.1 一般资料 选取2017年5月—2018年5月我院收治足癣患者共计326例，其中男性150例、女性176例，年龄18～50岁，近1个月内均未用过抗真菌药物。随机平分为三氧膏治疗组和酮康唑乳膏治疗组，每组各163例。诊断标准：参照《临床皮肤病学》[7]，根据临床表现：足跟、足跖、足趾及足旁的米粒大丘疹、水疱、片状脱屑，呈环状附于皮损边缘为主，伴有不同程度的瘙痒。同时结合实验室真菌分离检查确诊。所有患者符合皮肤真菌感染(足癣)诊断标准[8]。两组患者的一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2.2.2 治疗方法 患者早晚用温水将足部清洗干净，擦干水分，分别取三氧膏、酮康唑乳膏薄涂于患处，同时按摩促进渗透。两组均治疗14 d为1个疗程，治疗结束后复诊。治疗期间嘱患者尽量保持足部干爽、每日更换袜子。

1.2.2.3 疗效判断标准 (1)痊愈：皮损消退，无新发皮疹；(2)显效：皮损消退60%以上；(3)有效：皮损消退30%～60%；(4)无效：皮损消退不足30%或无变化。临床治疗疗效总有效率为痊愈、显效在患者中所占比例之和。

1.2.3 统计学方法

2 结果

2.1 抑菌圈直径比较

结果见表1。三氧膏、酮康唑乳膏对白色念珠菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌和石膏样小孢子菌等4种致病真菌的抑菌圈直径范围分别为26.62～31.64 mm、29.44～34.49 mm，试验菌对两种药物均表现为高度敏感，但两种药物的抗菌活性差异无统计学意义(P>0.05)。紫草膏、乳膏基质抑菌圈直径均为9.20 mm，表现为无抗菌作用，两者间比较差异无统计学意义(P>0.05)。三氧膏、酮康唑乳膏与紫草膏、乳膏基质的抑菌圈直径相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。对4种致病真菌的敏感程度强弱顺序依次为酮康唑乳膏>三氧膏>紫草膏=乳膏基质。

表1 不同药物对4种真菌的抑菌圈直径

Table1Inhibition zone diameter of different drugs on four kinds of fungiD/mm

真菌菌株三氧膏紫草膏酮康唑乳膏乳膏基质白色念珠菌26.62±0.44*#9.20±0.00$&29.44±0.33*#9.20±0.00$&须癣毛癣菌28.29±0.40*#9.20±0.00$&34.43±0.43*#9.20±0.00$&红色毛癣菌30.97±0.47*#9.20±0.00$&32.05±0.57*#9.20±0.00$&石膏样小孢子菌31.64±0.52*#9.20±0.00$&34.49±0.49*#9.20±0.00$&

与乳膏基质比较：*P<0.05；与紫草膏比较：#P<0.05；与酮康唑乳膏比较：$P<0.05；与三氧膏比较：&P<0.05。

2.2 最低抑菌浓度比较

结果见表2、图1。紫草膏对4种致病真菌的抑制作用很弱，MIC值≥240 μg/mL；酮康唑乳膏则具有很强的抑制作用，MIC值范围为0.47～15 μg/mL；三氧膏亦具有较强的抑制作用，MIC值范围为0.94～15 μg/mL。三氧膏与酮康唑乳膏对4种致病真菌的MIC值与紫草膏相比，差异具有统计学意义(P<0.01)；三氧膏与酮康唑乳膏相比，对须癣毛癣菌、红色毛癣菌的MIC值差异具有统计学意义(P<0.05)，而对白色念珠菌、石膏样小孢子菌的MIC值差异则无统计学意义(P>0.05)。对4种致病真菌的抑制强弱顺序依次为酮康唑乳膏>三氧膏>紫草膏。

表2 不同药物对4种真菌的最低抑菌浓度

Table2MIC of different drugs on four kinds of fungiρ/(μg·mL-1)

真菌菌株三氧膏紫草膏酮康唑乳膏白色念珠菌7.50-15.0b>120a7.50-15.0b须癣毛癣菌1.88-3.75bc>120ac<0.12ab红色毛癣菌0.47-0.94bc>120ac0.12～0.24ab石膏样小孢子菌3.75-7.50bc>120ac0.94-1.88ab

与三氧膏比较：aP<0.05；与紫草膏比较：bP<0.05；与酮康唑乳膏比较：cP<0.05。

0.60.50.40.30.20.10.0酮康唑膏紫草膏三氧膏酮康唑膏紫草膏三氧膏酮康唑膏紫草膏三氧膏酮康唑膏紫草膏三氧膏1.41.21.00.80.60.40.20.0-0.21.21.00.80.60.40.20.01.21.00.80.60.40.20.0A15306000.240.943.75120ρ/(μg?mL-1)ABCDAAA

A.白色念珠菌； B.须癣毛癣菌； C.红色毛癣菌； D.石膏样小孢子菌。

图1不同浓度药物对4种真菌的抑制作用

Figure1Inhibitory effect of different concentration drugs on four kinds of fungi

2.3 两组足癣患者临床疗效的比较

结果见表3所示，三氧膏治疗组的足癣临床治疗总有效率为85.28%，酮康唑乳膏治疗组总有效率为79.75%，两者差异无统计学意义，表明三氧膏临床疗效与酮康唑相当。治疗过程中三氧膏治疗组未见任何不良反应，酮康唑乳膏治疗组有个别病例出现刺痛感。

表3 两组足癣患者临床疗效的比较

Table3Comparison of clinical efficacy of two groups of patients with tinea pedis [n(%)]

组别N痊愈显效有效无效总有效率三氧膏 16393(57.06) 46(28.22) 16(9.82) 8(4.91)139(85.28)酮康唑163 75(46.01)55(33.74) 18(11.04) 15(9.20)130(79.75)

3 讨论

目前，医用三氧疗法已在多种疾病治疗中开展应用，如肿瘤[9]、急性脑梗死[10]、慢性失眠[11]、关节炎[12]、口腔溃疡[13]、手足口病[14]等，前景十分广泛。

本文就三氧膏在抗真菌方面的活性研究发现，其对白色念珠菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌和石膏样小孢子菌等致病性真菌的抑菌圈直径为26.62～31.64 mm、MIC为0.47～15.0 μg/mL，均表现出显著的抑制作用；抗菌活性由强至弱依次为红色毛癣菌>须癣毛癣菌>石膏样小孢子菌>白色念珠菌。三氧膏抑制浅部真菌的作用机制可能是：三氧膏里面的三氧化学分子式为O3，三氧具有很强的氧化性，遇到生物大分子发生以下反应：O3+生物大分子→O2+O，单个氧原子具有很强的氧化性。细胞色素p450酶系能催化大量生物底物氧化，能从氧分子获得极强的氧化力，其活性部位含有一个结合于血红素卟啉基上的铁原子，与O2结合后形成铁氧配合物，即三氧膏中的O2与细胞色素p450酶系的血红铁相结合，干扰了浅部真菌细胞膜中麦角甾醇的生物合成，产生抗真菌作用。

足癣是由致病性皮肤丝状真菌引起的常见皮肤真菌病，具有高发病率及传染性，治疗不当则难以治愈。临床治疗效果显示，三氧膏对于足癣患者总有效率高达85.28%，效果显著；且治疗过程无不良反应，愈后暂未发现复发病例。因此，三氧膏作为新的绿色抗真菌药物，值得在临床上进一步推广应用。