赤水乌骨鸡TYR基因多态性及生物信息学分析

祖盘玉　李维　林家栋　李洪林　刘洋　牟腾慧　龙广丽　简华峰　张福平

摘要：【目的】找出赤水烏骨鸡和泰和乌鸡TYR基因外显子的多态位点（SNP），为后期利用分子遗传学技术选育乌度更深的赤水乌骨鸡提供参考依据。【方法】采用DNA混池结合PCR产物直接测序法，分析赤水乌骨鸡和泰和乌鸡TYR基因外显子的SNP位点，并对筛选出的SNP位点进行生物信息学分析。【结果】在泰和乌鸡中发现4个SNPs位点，分别为Exon1-C829T、Exon1-C921T、Intron1-A1018G和Intron2-T79A，其中，Exon1-C829T和Exon1-C921T为同义突变;在赤水乌骨鸡中发现5个SNPs位点，分别为Intron1-G156A、Intron2-T7C、Intron4-G201A、Intron4-C221T和Exon5-A205G（非编码区）。利用在线生物信息学分析软件对TYR基因突变前后编码区序列的mRNA二级结构进行预测分析，结果发现赤水乌骨鸡的mRNA二级结构未发生变化，而泰和乌鸡Exon1-C829T和Exon1-C921T的突变均引起mRNA二级结构改变，使得TYR基因mRNA二级结构最小自由能减小，即二级结构稳定性增加。赤水乌骨鸡TYR蛋白二级结构由α-螺旋、无规则卷曲、β-转角及扩展链组成，分别占26.65%、55.31%、3.41%和14.63%。【结论】Exon1-C921T突变可能会对鸡的肉色产生影响，故推测Exon1-C921T是影响赤水乌骨鸡和泰和乌鸡乌度差异的原因之一。

关键词： 赤水乌骨鸡;泰和乌鸡;TYR基因;SNP位点;生物信息学

中图分类号： S831.89                        文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）12-2806-06

Polymorphism and bioinformatics analysis of TYR gene in Chishui Black-bone Chicken

ZU Pan-yu1， LI Wei2， LIN Jia-dong1， LI Hong-lin1， LIU Yang1， MOU Teng-hui1，

LONG Guang-li1， JIAN Hua-feng1， ZHANG Fu-ping1*

（1College of Animal Sciences， Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region， Ministry of Education/Guizhou Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction， Guiyang  550025， China; 2Guizhou Management Station of Livestock Genetic Resources，

Guiyang  550001， China）

Abstract：【Objective】To find the polymorphic loci（SNP） of exon of TYR gene from Chishui Black-bone Chicken and Taihe Silky Fowl， and lay a foundation for the later cultivation of Chishui Black-bone Chicken with deeper Wudu by molecular genetics technology. 【Method】The TYR gene exon SNPs of Chishui black-bone chicken and Taihe Silky Fowl were analyzed by DNA pooling and direct sequencing of PCR products， and bioinformatics analysis on SNP selected was conducted. 【Result】It was found that there were four SNPs in Taihe Silky Fowl， namely：Exon1-C829T， Exon1-C921T， Intron1-A1018G， Intron2-T79A， among which Exon1-C829T and Exon1-C921T were synonymous mutations. Five SNPs were found in Chishui Black-bone Chicken， they were Intron1-G156A， Intron2-T7C， Intron4-G201A， Intron4-C221T， Exon5-A205G（non-coding region）. The bioinformatics analysis software was used to analyze the mRNA secondary structure of coding region of TYR gene before and after mutation. It was found that mRNA secondary structure of Chishui Black-bone Chicken did not change， but both Taihe Silky Fowl Exon1-C829T and Exon1-C921T caused changes in the secondary structure of mRNA， which resulted in the minimum free energy of the secondary structure of TYR gene mRNA， that was， the stability of the secondary structure increases. TYR protein secondary structure of Chishui Black-bone Chicken was consisted of α-helix， random coil， β-turn and extended chain which accounted for 26.65%， 55.31%， 3.41% and 14.63%. 【Conclusion】Exon1-C921T mutation may change the color of chicken meat. Exon1-C921T may be one of the reasons that affect the difference between Chishui Black-bone Chicken and Taihe Silky Fowl.

Key words： Chishui Black-bone Chicken; Taihe Silky Fowl; TYR gene; SNPs; bioinformatics

0 引言

【研究意义】赤水乌骨鸡是贵州省优良的肉蛋兼用型地方品种，具有抗潮湿、体型较大、耐热耐粗饲料、觅食能力强、生长速度快、肉质鲜美及营养成分丰富等优良特性（李思，2015），但与泰和乌鸡相比，其皮肤、胸肌、腿肌、舌头和骨膜的乌度均较浅。乌骨鸡的药用价值与其乌度（黑色素含量）密切相关（徐幸莲等，1999;郑从义等，1999），目前消费者对乌骨鸡品质的判断也都是基于其乌度。乌骨鸡的乌度与真黑色素和脱黑色素的含量有关，当真黑色素含量较高时，其皮肤呈褐色或黑色，若脱黑色素含量较高则呈黄色（Ito et al.，2000）。黑色素的合成速率及其合成量又与酪氨酸酶（TYR）密切相關（刘青等，2018），即TYR是催化酪氨酸合成真黑色素和脱黑色素的关键酶，TYR基因突变会引起其活性改变，进而影响组织黑色素沉积，最终促使哺乳动物被毛或家禽羽色及肤色白化（Tsai et al.，1999）。因此，研究TYR基因外显子多态性对进一步揭示乌骨鸡黑色素沉积规律及选育乌度更深的乌骨鸡具有重要意义。【前人研究进展】近年来的研究表明，TYR基因不仅影响动物的毛色，还对哺乳动物、鱼类及禽类的体色产生影响。在哺乳动物上，王斌等（2006）研究发现，白猴色素变化与TYR基因的多态杂合突变有关;Kausar等（2013）发现绵阳TYR基因C位点突变导致TYR发生功能性缺陷，进而影响黑色素合成。此外，TYR基因突变会导致眼睛、皮肤及毛发缺乏黑色素，即白化病（Arveiler et al.，2017）。Yoshimura等（2000）研究发现，携带TYR基因G308C突变的转基因小鼠无色素沉着，易发生白化病;孙婉（2017）在人类TYR基因编码区发现2个新的错义突变（W400G和Q273H），经PolyPhen-2预测得知这2个突变可能有害，甚至可能致病;徐盈等（2018）研究发现，眼皮白化病患者的父亲TYR基因编码区发生R116T突变，其母亲出现移码突变c.929insC，而患者这两种突变均有发生。在鱼类上，蒋燕玲（2016）对橘色双冠丽鱼体色进行研究，结果发现在褪色过程中，其TYR基因表达量表现为黑色显著高于灰色和黄亮色，而灰色和黄亮色的差异不显著;周爱国（2016）发现乌鳢皮肤组织的TYR基因表达量极显著高于白甲乌鳢;王良炎（2017）对黄河鲤TYR基因的研究发现，该基因参与黄河鲤体色形成，在黑色皮肤中含量最高，且其表达水平与黑色素细胞数量和分布存在一定相关性。在禽类上，Chang等（2006）、Sato等（2007）研究表明TYR基因外显子和内含子中的突变可导致鸡全身颜色和肉色变化;李国辉等（2012）、Zhang等（2015）研究表明TYR基因不同基因型均会影响鸡的肉色，且上调的TYR基因在黑鸡中具有更高表达量，推测TYR基因差异表达是影响乌骨鸡乌度的主要原因之一。可见，加强TYR基因多态性分析对选育乌度更深的赤水乌骨鸡具有重要意义。【本研究切入点】目前，有关家禽TYR基因多态性分析的研究主要集中在第1外显子、启动子及组织表达量方面，而针对赤水乌骨鸡的研究尚无相关报道。【拟解决的关键问题】采用DNA混池结合PCR产物直接测序法，分析赤水乌骨鸡和泰和乌鸡TYR基因外显子的多态位点（SNP），并对筛选获得的SNP位点进行生物信息学分析，旨在找出两个乌鸡品种TYR基因外显子的差异SNP位点，为后期利用分子遗传学技术选育乌度更深的赤水乌骨鸡提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

赤水乌骨鸡和泰和乌鸡均由贵州大学科研鸡场提供，为相同条件饲养至150日龄的健康鸡，在翅下静脉肝素钠抗凝采集血样。琼脂糖、Taq PCR MasterMix溶液及Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1. 2 基因组DNA提取

采用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，以紫外分光光度计测定总DNA的浓度和纯度，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，-20 ℃保存备用。

1. 3 引物设计与合成

根据GenBank上已公布的红色原鸡TYR基因序列（GenBank登录号NC_006088），利用Primer Premier 5.0对TYR基因的5个外显子（Exon1～Exon5）及部分内含子设计引物，引物详细信息见表1。

1. 4 PCR扩增及SNP位点鉴定

取144份赤水乌骨鸡和98份泰和乌鸡血样DNA，分别构建DNA混池并进行PCR扩增，以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，阳性PCR扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。运用DNASTAR中的Seq Man将DNA池测序结果与原序列（GenBank登录号NC_006088）进行比对分析，找出各种群的SNP位点。PCR反应体系25.0 μL：Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板2.5 μL，上、下游引物各1.8 μL，ddH2O 6.4 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，进行34个循环;72 ℃延伸10 min。

1. 5 TYR基因生物信息学分析

1. 5. 1 mRNA二级结构及蛋白二、三级结构预测 利用在线软件RNAfold web server（http：//nibiru.tbi. univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）对TYR基因突变前后编码区序列进行mRNA二级结构预测，并进行比对分析;同时以NPS@：SOPMA secondary structure prediction（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl？page=npsa_sopma.html）预测分析TYR蛋白二级结构，用SWISS-MODEL Interactive Workspace（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）预测TYR蛋白三级结构。

1. 5. 2 等位基因频率估算 运用MWSnap v3.00.74中的标尺测量各SNP位点等位基因相应的峰值，并估算等位基因频率（Ai）。Ai=Bi/（B1+B2），式中，Ai表示SNP位点某等位基因频率，B1和B2分别表示测序峰图上该等位基因1和2峰的高度。

2 结果与分析

2. 1 PCR扩增结果

PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果（图1）显示获得的目的条带单一清晰，片段大小与预期结果相符，说明设计的PCR扩增引物特异性较好，扩增产物可用于下一步的测序分析。

2. 2 TYR基因SNP位点鉴定结果

利用DNASTAR对赤水乌骨鸡和泰和乌鸡的TYR基因测序结果与GenBank上已公布的红色原鸡TYR基因序列（GenBank登錄号NC_006088）进行比对分析。由图2可知，以各外显子第1个碱基为+1，在Exon1上：泰和乌鸡种群在第921位（C921T，同义突变）、第829位（C829T，属于同义突变）和第1018位（A1018G，Intron1）发现有3个SNPs位点，而赤水乌骨鸡上未发现SNP位点，泰和乌鸡的TYR1引物单个测序验证结果如图3所示;在Exon2、Exon3和Exon4上：赤水乌骨鸡和泰和乌鸡在其外显子区的未发生任何变化;在Exon5上：赤水乌骨鸡发现1个SNP位点——A205G（反向测序），但位于非编码区（protein_id=XP_015135298.1）;在Intron1上，两个鸡品种均发现1个SNP位点，突变情况分别为赤G156A和泰T79A;在Intron2上，赤水乌骨鸡发现1个SNP位点（赤T7C）;在Intron4上，赤水乌骨鸡发现2个SNPs位点（赤G201A和赤C221T）。

2. 3 等位基因频率估算结果

由表2可知，赤水乌骨鸡Intron2-T7C、Intron4-G201A和Intron4-C221T突变前后的等位基因频率相等，Intron1-G156A突变后的等位基因频率小于突变前的等位基因频率;赤水乌骨鸡Exon5-A205G及泰和乌鸡Exon1-C829T、Exon1-C921T和Intron1-A1018G突变后的等位基因频率大于突变前的等位基因频率。

2. 4 TYR基因mRNA二级结构预测结果

利用在线软件RNA fold web serve对TYR基因突变前后编码区序列分别进行mRNA二级结构预测分析，结果发现赤水乌骨鸡和红色原鸡一致，而泰和乌鸡C829T和C921T的突变均引起TYR基因mRNA二级结构改变，具体表现为其最低自由能减小，而稳定性增加。泰和乌鸡TYR基因mRNA二级结构预测结果见图4。

2. 5 TYR蛋白二、三级结构预测结果

赤水乌骨鸡TYR蛋白二级结构与红色原鸡一致，由α-螺旋、无规则卷曲、β-转角及扩展链组成，分别占26.65%、55.31%、3.41%和14.63%，其结构图谱如图5所示。利用SWISS-MODEL | Workspace预测TYR蛋白三级结构，发现赤水乌骨鸡TYR蛋白三级结构主要由α-螺旋、β-转角和无规则卷曲构成（图6），与二级结构预测结果一致。

3 讨论

乌骨鸡黑色素具有抗氧化、抗衰老、延年益寿和抗紫外线等生物学功能（Lin and Chen，2005;Tu et al.，2009），泰和乌鸡也因此开发出许多保健食品和调味品，如乌鸡白凤丸、乌鸡白凤口服液、乌鸡膏、乌鸡酒及乌鸡精复合调味品等（邱礼平和姚玉静，2005）。目前，关于赤水乌骨鸡的保健作用仍停留在烹饪膳食方面，尚未加工生产出相关产品。赤水乌骨鸡乌度略浅于泰和乌鸡，但其生长速度及饲料转化率均高于泰和乌鸡，且维生素E、必需氨基酸、必需脂肪酸等含量高于大部分鸡种（李思，2015）。因此，利用分子遗传学技术选育乌度更深的赤水乌骨鸡，并进一步开发其食用及药用价值显得尤为重要。

本研究在两个乌鸡品种中共发现9个SNPs位点，仅泰和乌鸡的Exon1-C829T和Exon1-C921T位于编码区，且均为同义突变，其他SNPs位点均处于非编码区。其中，泰和乌鸡Exon1-C829T与陆晓屏等（2015）对他留乌骨鸡研究的SNP4位点、路宏朝等（2014）对略阳乌鸡研究的C849T位点属于同一位点;泰和乌鸡Intron1-A1018G与他留乌骨鸡SNP6位点（陆晓屏等，2015）是同一位点;赤水乌骨鸡Intron2-T7C与略阳乌鸡G23549C位点（路宏朝等，2014）是同一位点;赤水乌骨鸡Intron4-G201A和Intron4-C221T与他留乌骨鸡SNP18和SNP20位点（陆晓屏等，2015）分别属于同一位点。上述SNP位点均是基于羽色性状相关研究所获得，其是否是导致赤水乌骨鸡与泰和乌鸡乌度差异的原因有待进一步探究。

此外，泰和乌鸡Exon1-C921T与SNP5位点（陆晓屏等，2015）和2866C/T位点（张建勤等，2008）是同一位点，且该位点在宁夏固原鸡（肉色为淡黑色）、海南文昌鸡（肉色为淡黄色）、西藏藏鸡（肉色为淡黄色）中的优势等位基因型分别为CC型、CT型和CC型，在海赛克斯鸡种（肉色为白色）只检测到CT型和TT型，以TT型为优势等位基因型，且这两个基因型和等位基因分布在不同鸡品种间存在明显差异。本研究通过对Exon1-C921T位点mRNA二级结构进行预测，发现其最小自由能降低，而稳定性增加;对其等位基因频率估算发现T为优势等位基因，由此推测Exon1-C921T是影响赤水乌骨鸡和泰和乌鸡乌度差异的原因之一。

4 结论

Exon1-C921T突变很可能会对鸡的肉色产生影响，故推测Exon1-C921T是影响赤水乌骨鸡和泰和乌鸡乌度差异的原因之一。

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（責任编辑 兰宗宝）