基于两种电泳检测方法的华东野生菰ISSR遗传多样性分析

谢小燕　苏晓娜　王惠梅　江绍琳　吴建利　江绍玫

摘要：【目的】篩选更优的ISSR-PCR扩增产物电泳检测方法，分析我国华东地区野生菰种质资源遗传多样性，为建立和完善菰植物种质库及合理开发与利用菰资源提供理论依据。【方法】挑选7条ISSR引物对华东地区9个野生菰居群104份材料基因组DNA进行PCR扩增，其ISSR-PCR产物分别采用2%琼脂糖凝胶电泳和5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。【结果】2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，华东地区野生菰的多态性位点百分率（PPB）为63.49%、观测等位基因数（Na）为1.6349、有效等位基因数（Ne）为1.3012、Nei’s基因多样性指数（He）为0.1871、Shannon’s信息指数（I）为0.2908、居群间遗传分化系数（Gst）为0.3922、遗传相似系数（Gs）变化范围在0.8293～0.9775;其聚类分析结果表明，当遗传相似性系数阈值为0.885时，9个野生菰居群被分为两大类，SH（上海）和PYH（鄱阳湖）居群归为一类，其他7个居群归为另一类。5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示，华东地区野生菰的PPB为78.03%、Na为1.7803、Ne为1.2762、He为0.1804、I为0.2914、Gst为0.5086、Gs变化范围在0.7679～0.9837;其聚类分析结果表明，当遗传相似性系数阈值为0.850时，9个居群也被分为两大类，其中PYH居群单独为一类，其他8个居群归为另一类。【结论】我国华东地区野生菰种质资源遗传多样性丰富，居群间和居群内变异显著，基于ISSR分子标记的野生菰遗传多样性采用5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测可获得更可靠的遗传图谱，而2%琼脂糖凝胶电泳检测更适合早期的ISSR分子标记引物筛选。

关键词： 野生菰;ISSR分子标记;遗传多样性;琼脂糖凝胶电泳;聚丙烯酰胺凝胶电泳;华东地区

中图分类号： S519;Q943                              文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）12-2638-09

Genetic diversity analysis of Zizania latifolia by ISSR in East China based on two electrophoresis detection methods

XIE Xiao-yan1， SU Xiao-na2， WANG Hui-mei3， JIANG Shao-lin4，

WU Jian-li3， JIANG Shao-mei5*

（1College of Art， Jiangxi University of Finance and Economics， Nanchang  330013， China; 2Nanchang Business College of Jiangxi Agricultural University， Nanchang  330013， China; 3China National Rice Research Institute， Hangzhou 310006， China; 4Agronomy College， Jiangxi Agricultural University， Nanchang  330045， China;

5College of Statistics， Jiangxi University of Finance and Economics， Nanchang  330013， China）

Abstract：【Objective】To select better electrophoretic detection methods for ISSR-PCR amplification products， analyze the genetic diversity of Zizania latifolia germplasm resources in East China， and provide theoretical basis for the establishment and improvement of Z. latifolia germplasm banks and the rational development and utilization of the resources.【Method】Seven ISSR primers were screened out to amplify 104 genomic DNA from 9 Z. latifolia populations in East China. The ISSR-PCR products were analyzed by 2% agarose gel and 5% non-denaturing polyacrylamide gel detection. 【Result】The results of agarose gel electrophoresis showed that the percentage of polymorphic loci（PPB） of Z. latifolia in East China was 63.49%， the number of observed alleles（Na） was 1.6349， and the number of effective alleles（Ne） was 1.3012， Nei’s genetic diversity index（He） was 0.1871， Shannon information index（I） was 0.2908， genetic differentiation coefficient（Gst） between populations was 0.3922， and genetic similarity coefficient（Gs） varied from 0.8293 to 0.9775. The results of cluster analysis showed that when the threshold of genetic similarity coefficient was 0.885， the nine Z. latifolia populations were classified into two categories， the SH（Shanghai） and PYH （Poyang Lake） populations were classified into one group， and the other seven populations were classified into another group. The results of 5% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis showed that the PPB of Z. latifolia in East China was 78.03%， Na was 1.7803， Ne was 1.2762， He was 0.1804， I was 0.2914， Gst was 0.5086， and Gs ranged from 0.7679 to 0.9837. The results of cluster analysis showed that when the threshold of genetic similarity coefficient was 0.850， the nine populations were also divided into two categories， among which the PYH population was classified into one category and the other eight populations were classified into another category. 【Conclusion】The Z. latifolia germplasm resources in East China are rich in genetic diversity， with significant variation between and within populations. The genetic diversity of Z. latifolia based on ISSR markers can be detected by 5% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis to obtain a more reliable genetic map， and 2% agarose gel electrophoresis detection is more suitable for early ISSR molecular marker primer screening.

Key words： Zizania latifolia; ISSR markers; genetic diversity; agarose gel electrophoresis; polyacrylamide gel electrophoresis; East China

0 引言

【研究意义】野生菰（Zizania latifolia）作为重要的宿根性水生草本植物，隶属于禾本科（Gramineae）稻亚科（Oryzoideae）稻族菰属（Zizania）（陈守良和徐克学，1994）。最新调查数据显示，华东地区是我国野生菰种质资源的重要分布地区之一，尤其在鄱阳湖、洪泽湖、太湖和巢湖等湖区大量分布（苏晓娜，2017）。菰具有较高的食用价值和营养价值，其颖果（菰米）早在周朝就成为供奉帝王的珍贵食材（翟成凯等，2000）。野生菰还具有极高的基因资源利用价值，与水稻生长习性有许多相似之处，可作为水稻遗传育种优良基因库的重要源材料（沈玮玮等，2010），已受到育种工作者的高度重视。野生菰基因存在自交退化、异交倾向，且颖果易落粒、种子收集难等现象（Kennard et al.，1999），但其分子生物学理论研究及实地试验基因改良尚处于起步和探索阶段（臧剑等，2017;王惠梅等，2018）。因此，选取琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种电泳方法对华东地区野生菰遗传多样性进行分析，选出最优检测方法，探索野生菰种群间的遗传变异规律，对菰遗传改良、种质资源库构建及物种保护与开发利用具有重要意义。【前人研究进展】目前，已有较多将分子标记用于野生菰遗传多样性及遗传结构的研究报道。Xu等（2008）利用Adh1a基因测序对我国野生菰居群进行遗传多样性及遗传结构分析，结果表明，各居群间存在低至中等水平的核苷酸差异，并证实我国东北地区居群Adh1a基因序列变异最丰富。Quan等（2009）开发了菰自身SSR分子标记并验证该标记用于野生菰遗传多样性具有可行性。Chen等（2012）利用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测长江中下游野生菰SSR-PCR扩增产物，结果表明该流域的野生菰具有高水平的遗传多样性。任绪瑞（2014）、吴国林等（2014）建立了菰ISSR和SRAP反应体系，扩增产物可用1%琼脂糖凝胶电泳和6%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。王惠梅等（2015）用1%琼脂糖凝胶电泳检测鄱阳湖流域野生菰ISSR-PCR扩增产物，结果显示该流域的野生菰遗传多样性较高，在遗传相似性系数0.728的水平上可将其分为三大类。苏晓娜（2017）利用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测华东地区野生菰资源SSR遗传多样性，得出多态性条带百分比高达89.06%，每对引物平均扩增出8.42个多态座位。董琳（2018）利用2%琼脂糖凝胶电泳分析梁子湖野生菰种质资源ISSR遗传多样性，结果发现该湖区的野生菰具有较高遗传多样性，居群内遗传变异大于居群间的变异。至今，琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是分子标记PCR扩增产物分离和检测的常用方法（王冬冬等，2017）。李新海等（2001）通过分析3%琼脂糖凝胶电泳和12%聚丙烯酰胺凝胶电泳对SSR分子标记多态性的影响，证实琼脂糖凝胶电泳适合用于遗传作图和基因定位研究，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于遗传多样性和指纹图谱研究。侯思宇等（2011）利用ISSR分子标记分析枣树品种遗传多样性时，发现5%聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率和多态性均高于1%琼脂糖凝胶电泳，且前者可获得更精细的枣树品种间遗传图谱。叶春秀等（2014）比较两种电泳方法对新陆早系列品种SSR分子标记結果的影响，发现聚丙烯酰胺凝胶电泳分析效果好且结果与实际遗传背景相近，而琼脂糖凝胶电泳更适合前期的引物筛选。刘乃新等（2016）研究不同检测方法对甜菜ISSR引物多态性的影响，发现6%聚丙烯酰胺凝胶电泳适用指纹图谱构建和遗传多样性分析，2%琼脂糖凝胶电泳适用于种子纯度鉴定。【本研究切入点】至今，国内尚未见同时使用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳对野生菰ISSR-PCR扩增产物进行检测的相关报道。【拟解决的关键问题】通过比较两种凝胶电泳对华东地区野生菰ISSR-PCR扩增产物的检测结果，筛选出更优检测方法，旨在真实反映华东地区野生菰遗传多样性特征，进一步将该标记及优选检测方法用于全国野生菰遗传多样性分析，为建立和完善菰植物种质库及合理开发与利用菰资源提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

9个野生菰居群104份样本采自华东地区的湖泊、湿地和公园里，同时详细记录各居群的经度、纬度、海拔及样本数量（表1）。Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、丙烯酰胺、琼脂糖、硝酸银、氢氧化钠和甲醛购自上海鼎国生物技术有限公司。主要设备仪器：PCR扩增仪（Tgradient Thermocycler，Biometra）、高速离心机（Centrifuge 5804，Eppendorf）、凝胶成像系统（Universal Hood II，BIO-RAD）、电泳槽电泳仪（DYY-6B、DYC-280，北京六一仪器厂）和凝胶扫描仪（Epson Perfection V10，EPSON）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 基因组DNA提取及ISSR扩增 参照周丽霞等（2013）的CTAB法提取菰基因组DNA，用ddH2O稀释至浓度为20 ng/μL，-20 ℃保存备用。选用的7条ISSR引物（吴国林等，2014）均由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成。PCR反应体系20.0 μL：10×Buffer 2.0 μL，2 mmol/L dNTPs 5.0 μL，2 U/μL Taq DNA聚合酶2.0 μL，20 ng/μL DNA模板1.0 μL，10 μmol/L引物0.5 μL，ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：94.0 ℃预变性3.0 min;94.0 ℃ 45 s，46.8～56.1 ℃ 45 s，72.0 ℃ 90 s，进行35个循环;72.0 ℃延伸7.0 min，4 ℃保存。

1. 2. 2 凝胶电泳检测 向PCR扩增产物中加入2 μL的6×Loading Buffer混匀后，用含核酸染料GelRed的2%琼脂糖凝胶电泳进行检测（100 V，1.5 h），电泳结束后在紫外凝胶成像系统（BIO-RED）下观察并拍照记录。同时，采用5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测（140 V，3 h），采用AgNO3染色法后分离和鉴定，用凝胶图像扫描仪拍照，并统计数据。

1. 2. 3 数据处理 以DL2000 DNA Marker为分子质量标准，采用人工读带方式，在相同迁移率位置谱带清晰可辨的记为“1”，缺失的记为“0”，在Excel 2007中构建二元数据矩阵。参照苏晓娜等（2018）的方法，采用POPGENE 1.32计算多态性位点百分率（PPB）、观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性指数（He）、Shannon’s信息指数（I）、居群间基因多样性（Ht）、居群内基因多样性（Hs）、居群间遗传分化系数（Gst）、居群间基因流（Nm）、遗传相似系数（Gs）和遗传距离（Gd）;利用ARLEQUIN 3.11计算居群间和居群内遗传变异所占比例;采用MEGA 4.0.2构建系统发育进化树;以MVSP 3.1进行主成分分析;并利用NTSYS 2.10e中的UPGMA法进行聚类分析（Rohlf，1998）。

2 结果与分析

2. 1 引物多态性分析比较

7条引物对104份野生菰DNA的扩增结果表明，扩增片段长度在100～2000 bp，但不同ISSR引物或同一引物扩增产物的不同电泳检测结果在谱带总数、带型和亮度等方面存在明显差异。2%琼脂糖凝胶电泳共检测到谱带63条，其中多态性谱带40条，PPB为63.49%;5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳共检测出谱带132条，其中多态性谱带103条，PPB为78.03%（表2）。对于7条引物的扩增产物，两种电泳检测方法获得的PPB范围分别为33.33%～88.89%和69.23%～95.00%（表3），其中，2%琼脂糖凝胶电泳和5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测出的最高谱带数分别为12条（引物Z89）和26条（引物Z88）。由于5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳具有更高分辨率，因此检测到的各引物多态性也较2%琼脂糖凝胶电泳好。

从居群分析结果可知，两种电泳检测方法均显示HZH和PYH居群多态性较高，ZHZ居群多态性最低。其中，2%琼脂糖凝胶电泳和5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测得出HZH、PYH、ZHZ居群的PPB分别为42.86%、34.92%、6.35%和47.73%、46.97%、6.06%。从引物Z73对部分野生菰样本的扩增结果可明显看出，5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测出的多态性（图2）高于2%琼脂糖凝胶电泳（图1），因而更易分辨出这31份野生菰样本的遗传差异。

2. 2 遗传多样性分析比较

He不仅反映一个物种等位基因的丰富度和均匀程度，还是衡量供试材料遗传多样性最常用的指标。采用POPGENE 1.32对9个野生菰居群的遗传参数进行统计，其中，2%琼脂糖凝胶电泳检测结果（表4）显示，Na=1.6349，Ne=1.3012，He=0.1871，I=0.2908;5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果（表5）显示，Na=1.7803，Ne=1.2762，He=0.1804，I=0.2914。两种检测方法分析结果基本一致，说明华东地区野生菰遗传多样性水平较高。

2. 3 遗传分化比较

2%琼脂糖凝胶电泳检测结果（表6）显示，华东地区野生菰居群间Ht=0.1777，居群内Hs=0.1080，Gst=0.3922，表明39.22%的遗传分化存在于居群间，60.78%则存在于居群内;5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果（表6）显示，华东地区野生菰居群间Ht=0.1661，居群内Hs=0.0816，Gst=0.5086，表明50.86%的遗传分化存在于居群间，49.14%则存在于居群内。Nm是基因间的相互交流引起居群内部遗传变异量增加，减少居群间分化。2%琼脂糖凝胶电泳和5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果（表6）显示，华东地区野生菰居群的Nm分别为0.7750和0.4832，均小于1.0000，说明遗传漂变成为影响居群遗传结构的主要因素。

分子变异分析（AMOVA）可用于判断居群间或居群内的变异方差分布情况。华东地区野生菰样本的AMOVA分析结果（表7）与POPGENE 1.32分析得出的相关参数基本一致，兩种电泳检测方法所得的野生菰居群间变异比例分别为32.06%和41.23%，居群内变异分别为67.94%和58.77%，居群间和居群内的变异均达极显著水平（P<0.01）。

Gs和Gd是衡量居群间遗传分化程度的两个最重要指标。2%琼脂糖凝胶电泳检测结果（表8）显示，华东地区野生菰各居群间Gs和Gd分别介于0.8293～0.9775和0.0227～0.1872。其中，ZHZ居群与CX居群的Gd=0.0227，Gs=0.9775，表明两个居群间的遗传差异最小，亲缘关系最近;PYH居群与ZHZ居群的Gd=0.1872，Gs=0.8293，表明两居群间的遗传差异最大，亲缘关系最远。5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果（表9）显示，华东地区野生菰各居群间Gs和Gd分别介于0.7679～0.9837和0.0165～0.2641。其中，ZHZ居群与CHH居群的Gd=0.0165，Gs=0.9837，表明两居群间的遗传差异最小，亲缘关系最近;PYH居群与ZZ居群的Gd=0.2641，Gs=0.7679，表明两居群间的遗传差异最大，亲缘关系最远。

2. 4 聚类分析比较

NTSYS 2.10e聚类分析是通过Similarity程序中的Qualitative data对原始数据矩阵进行遗传相似性系数计算，然后通过Clustering中SNAN程序的非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，最后借助Graphic中Tree Plot程序生成聚类分析图。由于PCR扩增产物检测方法的不同，导致华东地区野生菰聚类分析结果存在一定差异。在遗传相似性系数阈值为0.885时，2%琼脂糖凝胶电泳检测结果将华东地区9个野生菰居群分为两大类（图3），其中，第I类由ZZ、HZH、TAIH、CX、ZHZ、HZ和CHH 7个居群组成，第II类由SH和PYH 2个居群组成。在遗传相似性系数阈值为0.850时，5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果也将华东地区9个野生菰居群分为两大类（图4），其中，第I类由ZZ、SH、CX、HZ、CHH、ZHZ、HZH和TAIH 8个居群组成;第II类仅含PYH居群。

系统发育进化树是基于共同祖先原则，用于描述生物传代谱系的常用表达方式，可直观反映分类群（物种或基因）间的亲缘关系和进化方向（韩凤侠，2008）。借助MEGA 4.0.2的Neighbour-joining邻接法，可将居群间遗传距离转化为系统发育进化树。基于2%琼脂糖凝胶电泳检测结果的系统发育进化树显示，华东地区9个野生菰居群可明显聚为两大分支（图5），其中，A分支先后分化出SH和PYH居群，而B支先后分化出CHH、TAIH、HZH、ZZ、CX、HZ和ZHZ居群。基于5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果的系统发育进化树也显示，华东地区9个野生菰居群分为两大分支（图6），但各自分化出的居群与基于2%琼脂糖凝胶电泳的结果不同。其中，A支先后分化出CHH、ZHZ和PYH居群，B支则先后分化出CX、HZH、TAIH、HZ、SH和ZZ居群。

2. 5 主成分分析比较

采用MVSP 3.1对二元数据矩阵进行主成分分析（PCA），其中，基于2%琼脂糖凝胶电泳检测数据的主成分分析结果表明，前3个主成分所含信息量占总信息量的46.326%，第一主成分（PC1）～第三主成分（PC3）所占比例分别为25.825%、11.352%和9.149%，华东地区野生菰居群内各单株样本聚集较近，但居群间样本又存在相互交错，各居群无明显区分性（图7）;基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测数据的主成分分析结果显示，前3个主成分所含信息量占总信息量的46.575%，PC1～PC3所占比例分别为22.544%、16.011%和8.019%，除居群内各单株样本聚集较近外，居群间又被明显区分开（图8）。可见，华东地区9个野生菰居群的两种电泳检测数据主成分分析结果与聚类分析结果一致。

3 讨论

聚丙烯酰胺凝胶电泳对ISSR-PCR产物检测的分辨率和灵敏度均高于琼脂糖凝胶电泳。李凌雨等（2003）研究发现，聚丙烯酰胺凝胶电泳较琼脂糖凝胶电泳更能真实地反映玉米自交系间的系谱关系;宋顺华和郑晓鹰（2005）通过分析不同电泳检测方法对甘蓝和大白菜品种多态性的影响，发现聚丙烯酰胺凝胶电泳检测多态率是琼脂糖凝胶电泳检测多态率的2倍。本研究通过分析华东地区9个野生菰居群104份样本的ISSR-PCR扩增产物，结果表明，2%琼脂糖凝胶电泳共检测到谱带63条，其中多态性谱带40条，PPB为63.49%，遗传相似性范围在0.8293～0.9775;5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳共检测出谱带132条，其中多态性谱带103条，PPB为78.03%，遗传相似性范围在0.7679～0.9837。可见，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测优于琼脂糖凝胶电泳检测，能更真实地反映华东地区野生菰遗传多样性。通常情况下，构建遗传多样性图谱及品种分析与鉴定等建议选择使用聚丙烯酰胺凝胶电泳;但琼脂糖凝胶电泳因操作简便、成本低，尤其对于多态性要求不高的大量ISSR分子标记早期筛选仍是最常用的检测方法。

PPB和He是评价物种遗传多样性水平的常用指标。本研究采用的5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测得知华东地区野生菰PPB为78.03%、He为0.1804，与本课题组前期采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测基于SSR分子标记的我国华东地区野生菰种质资源遗传多样性分析结果（PPB为89.06%，He为0.2450）（苏晓娜，2017）基本一致。结合两种分子标记可更全面、准确地揭示种质遗传特性，同时说明SSR和ISSR分子标记均适用于我国华东地区野生菰的遗传多样性分析。本研究有效弥补了华东地区野生菰遗传多样性分子标记研究方法的不足，鉴于ISSR分子标记在菰属植物材料中表现出丰富的多态性和稳定性，而适合更广范围的野生菰品种鉴定工作。华东地区野生菰居群遗传关系存在明显的地理相关性，即地理距离越近的居群，其遗传距离越小，亲缘关系越近。本研究的聚类分析结果显示，在遗传相似系数为0.850处，可将9个野生菰居群分为两组，第I组由枣庄、上海、慈溪、杭州、巢湖、漳州、洪泽湖和太湖8个居群组成，而鄱阳湖为第II组，证实采用ISSR分子标记鉴别野生菰遗传亲缘关系具有可行性。华东地区野生菰的生长繁殖及其遗传演化受制于生活环境的水文条件变化，除受动物迁徙及风媒传播影响外，种子和根茎还可通过纵横交错的水体交流。此外，基于5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果的系统发育进化树也显示华东地区野生菰居群可分为两大分支，其中，A支先后分化出巢湖、漳州和鄱阳湖居群;B支先后分化出慈溪、洪泽湖、太湖、杭州、上海和枣庄居群。由此得出的野生菰居群亲缘及进化关系，与各野生菰居群所处的地理关系基本吻合。

华东地区野生菰遗传多样性的科学评价可进一步完善菰属植物野生种质资源信息。同时，本研究筛选出的ISSR分子标记及其产物的最优电泳检测方法——聚丙烯酰胺凝胶电泳，可用于全国范围野生菰及其他野生植物种质资源的评价研究，为我国野生植物资源收集、评估和利用打下基础。

4 结论

我国华东地区野生菰种质资源遗传多样性丰富，居群间和居群内变异显著，基于ISSR分子标记的野生菰遗传多样性采用5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测可获得更可靠的遗传图谱，而2%琼脂糖凝胶电泳检测更适合早期的ISSR分子标记引物筛选。

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（責任编辑 兰宗宝）