寒证大鼠细胞色素P450亚酶的表征及肉桂的调控

常新林 胡亚丹 钟婷 李坤丽 张玉杰 孙振晓 杨洁 张园园

摘要  目的：考察寒证大鼠肝脏细胞色素P450（CYP450）亚酶的表征特点及热性中药的调控效果。方法：选取知母-石膏-黄柏-龙胆草制备寒性造模药，对SD大鼠诱导21 d后复制寒证模型;另取肉桂提取物对寒性大鼠进行干预，制备观察组;用生理盐水处理为对照组。钙盐沉淀法制备肝脏微粒体，与混合探针药物温孵，用高效液相色谱（HPLC）法测定探针药物的代谢消除百分率，评价CYP450亚酶活性变化。提取肝脏总RNA，实时荧光定量PCR法测定CYP450亚酶的mRNA表达。结果：寒性中药对大鼠CYP3A1酶的活性和mRNA具有显著的抑制作用，热性肉桂具有一定的调控作用，并且这种调控发生在mRNA水平。结论：本研究从多角度系统评价和验证寒证机体CYP450亚酶的表征特点及热性中药的调控效果。

关键词  寒证;大鼠;肉桂;细胞色素P450;Cocktail探针法;mRNA;造模;调控

Characterization of CYP450s in Cold Syndrome Rats and the Regulative Effect of Cinnamomum Cassia

Chang Xinlin，Hu Yadan，Zhong Ting，Li Kunli，Zhang Yujie，Sun Zhenxiao，Yang Jie，Zhang Yuanyuan

（School of Chinese Materia Medica，Beiing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Abstract Objective： To study the characterization of five kinds of CYP450 in the liver of cold syndrome rats and the regulative effect of heat traditional Chinese medicine. Methods： Cold syndrome model was induced in SD rats for 21 days by gavage of Anemarrhena asphodeloides-Gypsum Fibrosuum-Cortex Phellodendri-Gentiana scabra.In addition，cold syndrome rats were treated with Cinnamomum cassia extract to prepare the treatment group.Saline was used as the control medicine.The liver microsomes were prepared by calcium precipitation method，incubated with mixed probe drugs，and the percentage of metabolic elimination of the probe drugs was determined by HPLC method to evaluate CYP450 activity.Total RNA was extracted from the liver and mRNA expression of CYP450s was determined by real-time fluorescent quantitative PCR. Results： The cold medicine can inhibit the activity and mRNA of CYP3A1 in rats.Cinnamomum cassia has a certain regulative effect which took place at mRNA level. Conclusion： This study should be further combined with protein expression experiments to evaluate and verify the characteristics of CYP450 enzyme in cold syndrome and the regulation effect of heat traditional Chinese medicine from multi-angle system.

Key Words  Cold syndrome; Rat; Cinnamomum cassia; CYP450; Cocktail probe method; mRNA

中图分类号：R282 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.015

中药药性理论是中医药基本理论之一，寒热药性理论是其基础和核心。以偏纠偏是药物治疗作用的本质所在，即“热者寒之、寒者热之”。现代基因技术、代谢组学和药物动力学等研究表明，寒、热证候下机体的代谢网络明显偏离正常，而经中药干预后模型动物的代谢谱回归至正常范围，呈现一定的网络修复的效果[1-4]。细胞色素P450酶（CYP450酶）为机体代谢网络中最重要的功能蛋白，是机体内、外源小分子物质代谢的主要承担者，在维持机体内环境的稳态、代谢对机体有害的物质和免疫方面发挥着重要作用[5]。研究表明，热证（寒证）下，机体肾上腺皮质激素、性激素等类固醇激素，胆固醇、脂肪酸等内源性物质代谢异常[6-9]，CYP450酶作為直接参与上述物质代谢的功能蛋白[10]，其表达水平的特异性改变将反映热证（寒证）下机体代谢网络特点。另有研究报道配伍热性药后，寒性药对CYP450酶的抑制作用得到调控[11-12]。我们选取肝脏中含量较高的5种CYP450亚酶，以寒证模型大鼠为载体，采用热性中药肉桂进行干预，从酶的活性和mRNA表达水平考查寒证机体CYP450酶的表征特点及热性中药的调控效果，考察CYP450酶与中药药性的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取雄性Sprague-DawLey（SD）大鼠24只，体质量（200±10）g，购自北京维通利华实验动物中心，许可证号SCXK（京）2012-0001。大鼠于实验室常规饲养，实验前禁食12 h，自由饮水。

1.1.2 药物 肉桂、知母、石膏、黄柏、龙胆草药材购自北京同仁堂药店，经北京中医药大学药用植物教研室王学勇教授鉴定。

1.1.3 试剂与仪器 探针药物美托洛尔（CYP2D1底物）、氨苯砜（CYP3A1底物）、非那西丁（CYP1A2底物）、氯唑沙宗（CYP2E1底物）、甲苯磺丁脲（CYP2C11底物），内标五味子醇甲，NADPNa2，D-葡萄糖-6-磷酸二钠、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、考马斯亮蓝G-250均购于Sigma公司;乙腈、甲醇为色谱纯（美国Fisher）;引物、RT试剂、荧光定量PCR试剂、sybr greenI均购自ShineGene公司。LC-10AT高效液相色谱仪（日本岛津），FTC2000荧光定量PCR仪（加拿大Funglyn Biotech）;GL-21M高速冷冻离心机（上海卢湘仪）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 采用水煎法制备。分别称取造模用（知母-生石膏-黄柏-龙胆草1.5∶ 2∶ 1∶ 1）[13]、治疗用（肉桂）药材，8倍量水浸泡1 h，回流提取1 h，滤过后用6倍量水回流提取30 min，2次药液合并，减压浓缩至造模用药液浓度为1 g生药/mL，低剂量观察组药液浓度为1 g生药/mL，高剂量观察组药液浓度为3 g生药/mL。

1.2.2 给药方法 采用造模药复制热证模型，每鼠每日上午灌胃给予4 mL造模用药液，连服21 d;正常对照组给予等体积生理盐水。第8天起每日下午，观察组分别灌胃给予相应的药物治疗（10 mL/kg），模型对照和正常对照组给予生理盐水（10 mL/kg），连续14 d。大鼠末次给药后2 h腹腔注射25%的乌拉坦麻醉处死，取肝组织剪碎、漂洗、吸干，-80 ℃保存。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 Cocktail实验

1）大鼠肝微粒体的制备 取大鼠肝组织，按1∶ 3的比例加入KCL缓冲液，匀浆。将匀浆液于4 ℃，4 500 r/min离心20 min，再取上清液与88 mmol/L CaCl2溶液混匀，使终浓度为8 mmol/L，冰浴5 min，再于4 ℃，13 000 r/min，离心20 min，用KCl缓冲液洗涤沉淀1次，所得微粒体以Tris-蔗糖缓冲液（pH7.4）混悬，-80 ℃保存[14]。

2）温孵条件及样品处理 精密量取各探针药物溶液于PE管中，氮气吹干，加入200 μL大鼠肝微粒体蛋白（2 mg/L），于37 ℃水浴均匀振荡3 min，加入200 μL NADPH-发生系统，于37 ℃水浴中反应30 min后立即按1∶ 3的比例加入冰甲醇终止反应，加入20 μL 0.06 mg/mL内标，于4 ℃，6 000 r/min，离心20 min。取上清液氮气吹干，甲醇溶解后用高效液相色谱（HPLC）法分析。

3）HPLC实验 迪马C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），（NH4）2HPO4缓冲盐（A，pH 3.6），乙腈（B）梯度洗脱，程序如表1，流速：1.0 mL/min，柱温：40 ℃，检测波长230 nm。色谱图如图1所示。可见5种探针药物与内标物峰形良好，空白肝微粒体实验也未见干扰，方法专属性强。

用HPLC法测定各探针底物浓度，计算代谢消除百分率。公式如下：

探针底物代谢消除百分率（%）=     加入探针底物的量-测得探针底物的量 加入探针底物的量 ×100

1.2.3.2 实时荧光定量PCR

1）RNA的提取与鉴定 取剪碎的肝组织，每50～100 mg加入1 mL TRIzol试剂，按试剂说明书进行提取，将提取的RNA溶解于适量无RNase水中。空白组A260/A280=1.97;实验组A260/A280的结果介于1.8～2.0，即没有残余蛋白，RNA纯度较高（图2）。

2）逆转录  配制逆转录反应体系（总体积20 μL），其中含2×RT buffer 10 μL、6N随机引物（100 pmol/μL）1 μL、RT-mix 1 μL、模板（RNA）5 μL、DEPC水3 μL。反应条件为25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min。

3）荧光定量PCR 对Cocktail法检测到有活性改变的3种亚酶进行mRNA水平检测。PCR反应体系（总体积50 μL）中包含2×PCR buffer 25 μL、Primers（25 pmol/μL）2 μL、Sybr green I（20 pmol/μL）0.5 μL、模板（cDNA）2 μL、DEPC水20.5 μL。扩增条件为94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s，退火温度为60 ℃ 30 s，72 ℃30秒循环35次，72 ℃检测信号。以β-actin为内参基因，进行PCR扩增产物的实时定量分析，用2-△△CT方法分析mRNA的表达。检测的CYP450亚酶及特异性引物序列见表2。

1.3 统计学方法 采用SAS 9.3统计软件处理。代谢消除百分率以均值±标准差（  ±s ）表示，组间平均值比较采用LSD-t检验，以 P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CYP450亞酶的活性 与空白组比较，寒性造模药物可非常显着抑制CYP3A1、CYP1A2的活性。治疗后，肉桂高剂量组对寒证大鼠CYP3A1的活性有非常显著的上调趋势，肉桂高、低剂量组对寒证大鼠CYP1A2的活性都有显著上调作用。对于CYP2E1，寒性中药对大鼠肝微粒体该酶活性无显著影响，给予高剂量肉桂后，酶活性被诱导。而CYP2D1和CYP2C11活性未受药物影响。见表3。

2.2 CYP450亚酶的mRNA表达 表明在mRNA水平，寒性大鼠CYP3A1的表达也被显著抑制。给予热性药肉桂后，寒证大鼠CYP3A1的mRNA表达上调。而给药组CYP1A2、CYP2E1的mRNA与空白组无差异，即酶活性改变的机制不是发生在mRNA水平。见表4。

3 讨论

CYP450酶为體内最重要的代谢酶，仅CYP2D6、CYP3A、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19五种亚酶就参与了90%的药物代谢[15]，其在大鼠体内的同源蛋白分别为CYP2D1、CYP3A1/2、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C11。其中CYP3A是人体内表达最丰富的CYP450酶，在药物代谢中发挥绝对重要的作用，可代谢进50%的药物。本研究表明，寒性中药对大鼠CYP3A1酶的活性和mRNA具有显著的抑制作用，热性肉桂具有一定的调控作用，并且这种调控发生在mRNA水平。

本研究选取Cocktail探针药物法考查酶活性，从而探讨寒证机体CYP450酶的表征特点及热性中药的调控效果，方法的优点在于可以在单个试验过程获得多个代谢途径的信息，从而真实地反映出药物对CYP450不同亚型代谢酶的影响，此外，该方法受个体间的差异影响也比较小，省时经济、简便灵敏。

药物对CYP450酶活性的影响机制包括酶的基因表达、转录水平、翻译水平等多方面。只有CYP450同工酶的活性、蛋白水平和mRNA水平都降低（升高）才表明该酶被抑制（诱导）[16]。因此，本研究要进一步结合蛋白表达实验，从多角度系统评价和验证寒证机体CYP450酶的表征特点及热性中药的调控效果。

参考文献

[1] 王米渠，冯韧，严石林，等.基因表达谱芯片与中医寒证的7类相关基因[J].中医杂志，2003，44（4）：288-289.

[2]冯韧.用基因芯片研究热药治疗寒证的差异基因表达谱[D].成都：成都中医药大学，2004.

[3]周红光.代谢组学在中医基础理论研究中的应用[J].中国中医药信息杂志，2013，20（9）：101-104.

[4]陈烁，王秀凤.肾阳虚证代谢组学研究进展[J].广东药科大学学报，2015，31（6）：829-832.

[5]Slaughter RL，Edwards DJ.Recent advances：the cytochrome P450 enzymes [J].Ann Pharmacother，1995，29（6）：619-624.

[6]王子晨，张建军，朱映黎，等.阿萨伊对虚热和虚寒证大鼠的脂肪代谢、免疫物质和内分泌激素的影响[J].中国中药杂志，2017，42（13）：2552-2557.

[7]秦路平，张汉平，张卫东，等.蛇床子素和蛇床子总香豆素对肾阳虚大鼠血清甲状腺激素和促甲状腺激素的影响[J].中国中西医结合杂志，1996，16（9）：552-553.

[8]成秀梅，杜惠兰，路帅，等.寒凝血瘀模型大鼠下丘脑神经递质的变化及其对生殖内分泌的影响[J].北京中医药大学学报，2012，35（10）：670-672.

[9]闫波，孙国祥，孙万阳，等.中药寒热温凉四性研究方法与思路[J].中南药学，2016，6（6）：572-580.

[10] 赵阳阳，许智慧，刘妍，等.细胞色素P450 基因多态性与药物代谢研究进展[J].临床药物治疗杂志，2017，14（4）：6-11.

 [11] 田义超，周静，徐凌云.银杏内酯B注射液对大鼠体外肝微粒体CYP1A2活性的影响[J].中国临床药理学杂志，2014，30（3）：204-207.

[12]奚丽君.以半夏药对研究七情配伍对细胞代谢酶P450 的影响[D].南京：南京中医药大学，2009.

[13]梁月华，李薪萍，任红.寒证热证时中枢、内脏、尿内儿茶酚胺及5-羟色胺的变化[J].中医杂志，1991，32（12）：38-40.

[14]韦灵玉，张玉杰，魏宝红，等.黄连黄芩及配伍诱导对大鼠肝微粒体5种CYP450 亚酶活性的影响[J].中国中药杂志，2013，38（9）：1426-1428.

[15]爱德华.类药性质—概念、结构设计与方法，从ADME到安全性优化[M].钟大放译.北京：科学出版社，2011：186.

[16]陈西敬.药物代谢动力学研究进展[M].北京：化学工业出版社，2008：100.