聚酰胺色谱法联合中压液相制备色谱法提取分离镰形棘豆中活性黄酮类成分

牛俐燃 李冠聪 杨光明 潘扬 蔡宝昌

摘要  目的：對藏药镰形棘豆中黄酮类成分进行提取分离，并将得到的黄酮化合物进行抗人肺腺癌A549细胞的活性筛选。方法：镰形棘豆药材浸提液经乙酸乙酯萃取，该萃取部位通过聚酰胺柱色谱梯度洗脱，结合中压液相制备色谱法进一步纯化分离，获得单一黄酮化合物，通过高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）及核磁共振波谱法（NMR）对化合物进行分析、鉴定;采用CCK-8法，检测黄酮化合物对人肺腺癌A549细胞的抑制作用。结果：从镰形棘豆的乙酸乙酯部位分离得到2个黄酮类单体，鉴定为7-羟基二氢黄酮及2′，4′-二羟基二氢查尔酮，HPLC分析两者纯度均大于98%;CCK-8法结果显示，7-羟基二氢黄酮及2′，4′-二羟基二氢查尔酮均能显著抑制A549细胞活力，并呈量效关系，48 h的IC50值分别为137.6 μg/mL和63.83 μg/mL。结论：分离得到的2个黄酮成分对A549细胞均有良好的抑制作用，为后期抗肺癌机制研究提供了实验基础。聚酰胺柱色谱法具有富集黄酮的作用，适用于分离黄酮类成分，聚酰胺色谱法联合中压制备液相色谱法，提取分离镰形棘豆中黄酮类成分，简便易行，为分离黄酮类成分提供参考。

关键词  镰形棘豆;黄酮化合物;聚酰胺色谱法;中压制备色谱法;A549细胞;质谱法

Extraction and Separation of Bioactive Flavonoids from Oxytropis Falcata by Polyamide Chromatography Combined with Medium-pressure Liquid Chromatography

Niu Liran1，2，Li Guancong1，2，Yang Guangming1，2，Pan Yang1，3，Cai Baochang1，2

（1 School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 2 Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Standardization of Chinese Medicine Processing & Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing，Nanjing 210023，China; 3 Laboratory of Medical Fungi and Phyto-Biotech，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Abstract Objective： To extract and isolate the flavonoids from Oxytropis falcata （Of），and screen bioactive flavonoids on human lung adenocarcinoma A549 cells in vitro. Methods： Crude extraction was extracted from Of by ethyl acetate.Ethyl acetate extraction was further separated by polyamide column chromatography with gradient elution and purified by medium-pressure liquid chromatography to obtain the flavonoids; High performance liquid chromatography （HPLC），mass spectrometry （MS） and nuclear magnetic resonance spectroscopy （NMR） were used to analyze and elucidate the structure of the obtained flavonoids.CCK-8 analysis was used to detect the inhibited viability of flavonoids on human lung adenocarcinoma A549 cells in vitro. Results： There were 2 flavonoids isolated from Of ethyl acetate fraction，and were identified as 7-hydroxy dihydroflavone and 2′，4′-dihydroxy dihydrochalcone.Purity of them were both greater than 98% by HPLC analyses; The results of CCK-8 showed that 7-hydroxy dihydroflavone and 2′，4′-dihydroxy dihydrochalcone could significantly inhibit the viability of A549 cells in a dose dependent manner.The IC50 values were 137.6 μg/mL and 63.83 μg/mL at 48 h，respectively. Conclusion： The 2 flavonoids have effective bioactivities on inhibiting proliferation of human lung adenocarcinoma A549 cells，which could provide the experimental basis for the further studies on anti-lung cancer mechanism.Polyamide column chromatography is suitable for enrichment and isolation of flavonoids.Polyamide column chromatography combined with medium pressure liquid chromatography is simple and easy to prepare various flavonoids.Thus，the method could provide a reference for obtaining flavonoids from Chinese medicines.

Key Words  Oxytropis falcata; Flavonoids; Polyamide column chromatography; Medium-pressure liquid chromatography; A549 cells; Mass spectrometry

中图分类号：R284.1 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.005

镰形棘豆（ Oxytropis falcata  Bunge）为豆科棘豆属植物，多年生无茎草本，藏族人称之为“莪大夏”“达夏”[1]。据《晶珠本草》[2]及《中华人民共和国卫生部药品标准》藏药第1册记录[3]，其根及根茎或全草入药，味辛、性寒，有小毒，具有清热解毒、生肌愈疮、涩脉止血等疗效。内服可治疗流感、扁桃体炎、炭疽及麻风等，外敷可治疗疮疖肿痛、创伤及骨伤等，具有广阔的开发前景。藏药镰形棘豆中富含黄酮类化合物。文献报道已分离得到黄酮苷、黄酮及二氢黄酮、二氢查耳酮、查耳酮、黄酮醇、异黄烷及黄烷酮等成分[4-6]，且这些黄酮成分具有显著的药理活性[7-8]，是评价镰形棘豆药效的重要依据。因此，完善镰形棘豆黄酮类成分的制备工艺，提高黄酮类成分的得率及纯度，对于进一步开发利用镰形棘豆的药用资源具有重要意义。聚酰胺色谱法对各种黄酮类化合物均有较好的富集纯化效果[9-10]，中压制备液相色谱法单次上样量大、步骤简便，适合单体的规模化提取分离[11]。本实验采用聚酰胺色谱法结合中压液相制备色谱法，提取分离纯化镰形棘豆中黄酮类成分。通过2种方法的结合，实现了对镰形棘豆中黄酮类化合物快速、有效的分离纯化，得到了2个高纯度的黄酮类化合物，并将黄酮单体进行人肺腺癌A549细胞的活性筛选实验，为探索镰形棘豆资源的进一步开发应用和抗肿瘤活性成分研究提供依据。

1 材料

镰形棘豆药材于2016年12月采购自青海省共和县，经南京中医药大学药学院潘扬老师鉴定为豆科棘豆属植物镰形棘豆（ Oxytropis falcata   Bunge）的干燥全草;柱色谱用聚酰胺（100～200目，化学纯，国药集团上海化学试剂有限公司），Reveleris 4 g硅胶柱（美国GRACE公司）;乙酸乙酯、无水乙醇、石油醚、丙酮等液体试剂均为分析纯（南京化学试剂有限公司）;薄层层析硅胶G板（青岛海洋化工厂）;CCK-8试剂盒（南京恩晶公司，批号20180714）;RPMI 1640培养基、0.25%胰酶、胎牛血清（加拿大维森特公司，批号270636013）。

Mettler Toledo电子天平;Agilent 1260 Infinity型高效液相色譜仪;Büchi Reveleris X2中压液相制备色谱仪;X-4型数字显微熔点仪;LC/MS-2020单极四级杆质谱仪;Bruker-500核磁共振仪，TMS内标;VS-1300-U超净工作台;Eppendorf 5810R高速冷冻离心机;Perkin Elmer Victor X3酶标仪。

A549人肺腺癌细胞株，由南京中医药大学药理教研室惠赠。取A549细胞株于含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/L的RPMI 1640培养基中，37 ℃、5% CO2、90%相对湿度的培养箱中孵育，待细胞长至80%融合时，胰酶消化，按照细胞浓度需求传代，待细胞处于对数生长期时用于实验。

2 方法

2.1 提取与分离

2.1.1 镰形棘豆的提取

称取镰形棘豆药材10 kg，用体积分数95%的乙醇于室温下冷浸提取3次，每次浸泡3 d，减压抽滤，弃去残渣，合并提取液，于50 ℃下减压浓缩成浸膏;取上述浸膏500 g，经2%盐酸溶解，过滤，得酸性不溶物，再经2%氢氧化钠处理后过滤，滤液用1%盐酸调节pH至5;将酸水液经乙酸乙酯反复萃取，得乙酸乙酯萃取物100 g。

2.1.2 聚酰胺色谱富集分离

取100～200目聚酰胺粉，用体积分数95%的沸乙醇冷凝回流2 h后，抽滤、烘干。称取聚酰胺粉500 g，用超纯水搅拌均匀，湿法装柱，轻轻敲击玻璃柱至柱床面不再下沉，过程中始终保持水面高于聚酰胺，以超纯水为起始洗脱液，调节流速至约25 mL/min，用超纯水冲洗平衡。

2.1.3 中压液相色谱分离纯化

取乙酸乙酯萃取物20 g，经中压聚酰胺柱色谱进行分离，以水-无水乙醇为溶剂系统梯度洗脱（无水乙醇0～95%），等体积收集，各梯度流分经TLC检识合并，30%流分部位浓缩得到混合物A（2.5 g），50%流分部位得到混合物B（1.3 g）;混合物A和B分别取0.5 g，经中压液相制备硅胶柱进一步分离，以石油醚-丙酮为溶剂系统梯度洗脱，混合物A的流分5（石油醚-丙酮=100∶ 25）得到化合物I（30 mg），液相色谱分离行为见图1;混合物B的流分3（石油醚-丙酮=100∶ 15）得到化合物II（20 mg），液相色谱分离行为见图2。分离流程见图3。

2.2 人肺癌A549细胞生长抑制试验（CCK-8法）

取I、II化合物各4 mg，精密称定。加入50 μL的DMSO助溶，加入完全培养基5 mL，作为储备液，用时稀释，DMSO最终浓度不超过0.5%。将配制好的不同浓度的药物（6.25 μg/mL，12.50 μg/mL，25.00 μg/mL，50.00 μg/mL，100.00 μg/mL，200.00 μg/mL，400.00 μg/mL），以0.22 μm微孔滤膜（GVMP 01230，Millipore，USA）过滤除菌，4 ℃保存待用。

取对数生长期细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，接种于96孔板，每孔100 μL。培养24 h，待细胞贴壁后弃去原培养液，每孔加入预先配制好的不同浓度样品溶液各100 μL。每组平行设置6个复孔。置于孵箱内培养24 h及48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h，置酶标仪中检测，在波长450 nm处测定吸光度值（OD），每组重复3次。同时设立对照组，空白组。并按照以下公式计算细胞抑制率。

细胞抑制率（%）=1- 实验组OD-空白组OD 对照组OD-空白组OD ×100%。

3 结果

3.1 化合物结构鉴定

合物I：白色针晶，mp 188～190 ℃;ESI/MS（ m/z ）：240[M+H]+;1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.87（1H，d，J=8.5 Hz，H-5），7.47～7.36（5H，H-2′～6′），6.55（1H，dd，J=8.5 Hz，2.2 Hz，H-6），6.48（1H，d，J=2.2 Hz，H-8），5.58（1H，dd，J=12.7，3.0 Hz，H-2），3.07（1H，dd，J=16.8，12.7 Hz，H-3α），2.86（1H，dd，J=16.8 Hz，H-3β）;13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：190.83（CO），79.91（C-2），44.30（C-3），128.85（C-6，4′，5），110.63（C-6），163.62（C-7），103.45（C-8），162.82（C-9），115.16（C-10），138.75（C-1′），126.16（C-2′，6′），129.46（C-3′）。以上數据与文献[11]对照一致，故确定化合物I为7-羟基二氢黄酮（7-hydroxy flavonone）。其核磁氢谱、碳谱数据见图4和图5;结构式见图6。

化合物II：白色针晶，mp 89～91 ℃;ESI/MS（ m/z ）：242[M+H]+;1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：12.72（1H，s，OH），7.63（1H，d，J=8.6 Hz，H-6′），7.31～7.19（3H，m，H-2，4，6），5.68（1H，brs，OH），6.37（2H，m，H-3′，5′），3.20（3H，t，H-2α），3.04（2H，t，H-2β）;13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：203.6（CO），140.83（C-1），128.38（C-2，6），128.60（C-3，5），126.30（C-4），113.91（c-1′），162.48（C-2′），103.64（C-3′），165.26（C-4′），107.71（C-5′），132.20（C-6′），39.67（C-α），30.37（C-β）。以上数据与文献[13]对照一致，故确定化合物II为2′，4′-二羟基二氢查尔酮（2′，4′-dihydroxy dihydrochalcone）。其核磁氢谱、碳谱数据见图7和图8。结构式见图9。

3.2 化合物I、II对A549肺癌细胞生长抑制作用

CCK-8结果显示（见图10），7-羟基二氢黄酮（化合物I）及2′，4′-二羟基二氢查尔酮（化合物II）细胞给药24 h后，均对A549细胞的生长具有抑制作用，且抑制效果具有剂量依赖趋势，两者均在400 μg/mL时对细胞的增殖抑制作用最强，抑制率分别为62.3%和89.7%，给药48 h后两者最高浓度对细胞的抑制率分别为66.8%和90.6%，抑制效果与作用时间呈正相关趋势;IC50值结果显示（见表1），7-羟基二氢黄酮及2′，4′-二羟基二氢查尔酮细胞给药48 h后，IC50值分别为137.6 μg/mL和63.83 μg/mL。综上结果表明，7-羟基二氢黄酮及2′，4′-二羟基二氢查尔酮能够显著抑制人肺癌A549细胞增殖，具有良好的抗肺癌活性。

4 结论

藏药镰形棘豆具有镇痛抗炎、抗肿瘤等疗效，被誉为“草药之王”。近年来，确生[14]、魏学红[15]等国内学者对镰形棘豆的化学成分、提取工艺、药理作用和临床应用等方面开展了大量的研究工作，为开发利用镰形棘豆的药用植物资源奠定了良好的基础。黄酮类化合物作为主要的活性物质是镰形棘豆抗炎抗肿瘤研究的热点[16]。因此，研究镰形棘豆黄酮类成分的提取分离技术具有科研意义。

本研究采用聚酰胺柱色谱联用中压制备色谱的方法对镰形棘豆乙酸乙酯萃取部位进行分离纯化，得到2种黄酮单体成分;取7-羟基二氢黄酮及2′，4′-二羟基二氢查尔酮进行体外抗肺癌A549细胞活性筛选，结果表明，2种成分均能明显抑制A549细胞的增殖，并具有剂量依赖趋势，其中2′，4′-二羟基二氢查尔酮抑制效果更佳，给药48 h的IC50值为63.83 μg/mL。本文提取分离成分方法的创新之处在于，聚酰胺具有富集黄酮的作用，是较为理想的吸附剂，利用黄酮类化合物富含酚羟基的特点，通过分子中的酚羟基与聚酰胺分子中的酰胺基形成氢键缔合产生吸附，可显著提高黄酮成分纯度[17];与中压制备液相色谱法联用提取分离镰形棘豆中的黄酮单一成分，简便易行，提取效率快，单体成分纯度高，是分离纯化镰形棘豆黄酮类化合物的新手段;将制备得到的黄酮单体进行体外抗肺癌A549细胞实验，检测其抗癌活性，为研究及阐述镰形棘豆抗肿瘤活性黄酮单体成分及其抗肿瘤的作用机制奠定基础。

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