基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS的白芍炒制前后化学成分研究

任娟 刘晓 李伟东 蔡皓 朱晓钗 蔡宝昌

摘要  目的：采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法，探讨白芍炒制前后化学成分的变化。方法：采用Agilent C18色谱柱，0.1%甲酸水溶液-乙腈梯度洗脱，体积流量0.3 mL/min，串联四级杆飞行时间质谱分别测定不同产地各10批生、炒白芍中的化学成分。结果：分别在生、炒白芍中鉴定出40种化学成分。结论：通过UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术，为分析生、炒白芍中的化学成分提供一种快速、高效的分析方法，为综合评价生白芍和炒白芍的质量提供参考。

关键词  白芍;炒制;UHPLC-Q-TOF-MS/MS;四极杆;化学成分

Qualitative Analysis of Major Constituents of Raw and Processed Paeonia Lactiflora by UHPLC-Q-TOF-MS/MS

Ren Juan1，2，Liu Xiao2，Li Weidong2，Cai Hao2，Zhu Xiaochai2，Cai Baochang2，3，4

（1 Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210009，China; 2 Engineering Center of State Ministry of Education for Standardization of Chinese Medicine Processing，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 3 Nanjing Haiyuan Prepared Slices of Chinese Crude Drugs Co.Ltd，Nanjing 210061，China; 4 Nanjing Haichang Chinese Medicine Corporation，Nanjing 210061，China）

Abstract Objective： By using ultra-high performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry，to investigate the changes of chemical composition in Paeonia lactiflora before and after progressed. Methods： Agilent C18 column，0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile gradient elution，volume flow rate 0.3 mL/min，tandem four-stage rod time-of-flight mass spectrometry were used to determine the chemical composition of 10 batches of raw and fried white peony in different producing areas. Results： A total of 40 chemical components were identified in raw Paeonia lactiflora （RPL） and processed Paeonia lactiflora （PPL）. Conclusion： UHPLC-Q-TOF-MS/MS technology provides a fast and efficient analytical method for the analysis of chemical constituents in RPL and PPL，which provides a reference for comprehensive evaluation of the quality of RPL and PPL.

Key Words  Paeonia lactiflora; Processing; UHPLC-Q-TOF-MS/MS; Quadrupole; Chemical components

中图分类号：R932 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.003

白芍（ Cynanchum otophyllum） 为毛茛科植物芍药（ Paeonia lactiflora  Pall.）的干燥根，气微，味微苦、酸，性微寒，归肝、脾经，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效，用于血虚萎黄、月经不调、自汗、盗汗、胁痛、腹痛、四肢挛痛、头痛眩晕[1]。现代药理学研究表明，白芍具有抗炎、镇痛、增強免疫、保肝等作用[2-4]。2015年版《中华人民共和国药典》收载其饮片品种有白芍、炒白芍、酒白芍。白芍经清炒后，以养血和营、敛阴止汗为主;经酒炒后，降低酸寒伐肝之性，入血分，善于调经止血，柔肝止痛[5]。现代研究表明，白芍中的化学成分主要有单萜苷类、酚酸类、没食子酰葡萄糖类、挥发油类等[6]，其中芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷和氧化芍药苷等单萜苷类化合物被认为是白芍的重要药效物质基础[7-9]。2015年版《中华人民共和国药典》通过测定芍药苷含量对白芍进行质量控制，但是中药具有多成分、多靶点的特点，测定单一成分难以反映饮片的整体质量，高效分离能力的色谱与高分辨、高灵敏的质谱串联技术已在多组分中药及复方成分定性分析中逐渐凸显出独特优势[10-12]。近年来针对白芍化学成分的研究已有文献报道[13-15]，但同时针对白芍和炒白芍中化学成分的研究尚少，故本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析白芍和炒白芍中的化学成分，为其质量控制提供较全面的依据。

1 儀器与试药

1.1 仪器 KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;BP121S电子分析天平（梅特勒-托雷多公司）。日本Shimadzu超高效液相色谱仪（配有LC-30AD二元液相泵、SIL-30SD自动进样器、DGU-20A5R在线脱气机、CTO-30A柱温箱）;美国AB SCIEX Triple TOF 5600+系统（配有电喷雾离子源ESI）;数据采集软件：Analyst TF1.6 software（ABSCEIX，USA）;数据处理软件系统：Peakview 1.2 software（AB SCEIX，USA）;30A超高效液相色谱分析系统（日本，岛津公司）;SPE固相萃取小柱。

1.2 试剂  质谱纯甲酸、质谱纯甲醇、质谱纯乙腈（德国E.Merck）;水为Milliporeill-Q超纯水，每日自制。

1.3 分析样品 实验中所用10批生白芍和10批炒白芍样品均购自医院和药店，经江苏省中医院副主任中药师袁家财鉴定，为毛茛科植物芍药（ Paeonia lactiflora Pall. ）的干燥根。

2 方法与结果

2.1 UHPLC-Q-TOF-MS/MS色谱质谱条件 色谱条件：采用Agilent C18反向色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流动相A（0.1%甲酸水）-B（乙腈），梯度洗脱，程序为0～2 min，5% ～13% B;2～12 min，13% ～19% B;12～15 min，19% ～33% B;15～18 min，33% ～55% B;18～22 min，55% ～100% B;流速0.3 mL/min;柱温35 ℃，进样体积2 μL。质谱条件：Q-TOF-MS/MS系统使用ESI离子源，分别在正、负离子模式下采集数据。ISVF为4 500/-4 500 V，TEM为550 ℃，DP为60/-60 V，CE为35/-35 eV，雾化气体为氮气，Gas1为55 psi（1 psi≈6.9 kPa），Gas2为55 psi，Curtain Gas为35 psi。 一级质谱母离子扫描范围为 m/z  100～2 000，二级质谱子离子扫描范围为 m/z  50～1 000，开启动态背景扣除（DBS）。

2.2 供试品溶液的制备 取白芍及炒白芍粉（60目）各0.5 g，精密称定，分别置50 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液35 mL，超声提取30 min，取出，用50%甲醇溶液定容。取1.5 mL溶液置2 mL离心管，13 000 r/min离心5 min，精密移取1 mL上清液过SPE柱，梯度洗脱：10%甲醇1 mL，30%甲醇2 mL，50%甲醇3 mL，70%甲醇2 mL，100%甲醇1 mL，合并洗脱液，取1.5 mL洗脱液置2 mL离心管，13 000 r/min离心5 min，取上清液即得。

2.3 数据库的建立 借助于CNKI、PubMed和SciFinder等数据库检索白芍相关文献，尽可能全面地建立包含中药白芍中所含化合物的分子式、分子质量和化学名称等信息数据库，并借助于ChemSpider、ChemicalBook等网络数据库下载各个化合物的mol文件，计算其在正离子模式下常见离子[M+H]+、[M+NH4]+和负离子模式下常见离子[M+COOH]-、[M-H]-等多种离子形态的精确质荷比数值[16-18]。

2.4 软件应用  将白芍生品和炒品的原始质谱数据导入PeakView软件中，通过分析比较各个化合物由总离子流图提取到的一级质量数与理论质量数比对以及二级碎片与其mol文件所对应的碎片之间的匹配进行化学成分确认，最终质量数误差5 ppm以内、结构匹配度达到80%以上的成分被鉴定出来。

2.5 成分鉴别和分析 白芍生品和炒品在正、负离子模式下的总离子流图。见图1。正、负离子2种模式下共鉴别出40种化合物。见表1。以芍药苷为例来说明鉴别过程，峰17的[M-H]-为479.155 89，对应分子式为C23H28O11，质量数为480.163 16，主要二级碎片为 m/z  121.030 8，327.108 1，479.179 7，77.042 9，与文献报道芍药苷的二级质谱碎片离子相一致，推测该化合物为芍药苷，将芍药苷的mol文件所预测的碎片与二级碎片进行匹配，最终确认该化合物为芍药苷。其他化合物采用类似鉴定方法，分别于生、炒白芍中鉴定出来40种成分，其化学种类主要是单萜苷类和酚酸类成分，从成分种类来看，白芍炒制前后没有质变成分。

3 讨论

供试品溶液制备时，考察了不同浓度甲醇作为提取溶剂，结果显示50%的浓度下，白芍TIC图谱上的峰较多，提取比较完全，又考察了分别用甲醇和乙醇作为提取液，发现甲醇提取峰形更好，所以选择用50%甲醇做提取溶剂。

白芍清炒后，药性缓和，药效偏于柔肝、和脾、止泻。本实验对炮制前后的化学成分进行研究，鉴定出的40种成分在生品和炮制品中种类未见显著性差异，白芍炒后药性缓和，可能是因为炒制后有效成分的含量发生了变化，有待进一步的研究。

本实验采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术，通过数据库匹配及二级结构分析，参考相关文献，鉴定了白芍和炒白芍中40种化学成分。该方法快速、简便、灵敏度高，可为白芍及其炮制品后续的化学成分研究、药理研究以及质量控制提供参考。

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