全基因组测序在食品安全预防中的利剑作用

推荐单位：国家食品安全风险评估中心

成果来源：国家食品安全风险评估中心

科研代表：王伟    转化作者：倪影

谈谈全基因组测序，认识它和我们健康息息相关的疾病预防、食品安全方面的关系。

2016年世界卫生组织发布的一份报告将威胁人类健康和生命的矛头直指受到污染的食品。报告称，全球范围内每年有多达6亿人因食用受到污染的食品而生病，全球每年有42万人因食源性疾病死亡。

沙门氏菌是引发全球性的食源性疾病的主要致病菌之一，世界卫生组织（WHO）已经将其列为具有中等危害和严重危害的食物传播性病原。蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介，受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。2006～2010年间我国报告的病因明确的细菌性食源性疾病暴发事件中，70%～80%是由沙门氏菌所致。同时，其所造成的疾病负担，经济损失、医疗负担和社会负担等都不容忽视。

因此，建立快速、有效的检测方法对沙门氏菌进行检测，将在食品安全保障、公共卫生监测以及禽病预防和控制中发挥巨大作用。另外，沙门氏菌耐药性的不断增强一直以来也是备受关注的全球性问题，通过对耐药性的监测，可以为防控沙门氏菌疫情暴发、合理使用抗生素提供科学依据。近年来，发展迅速的全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）在这方面功不可没，尤其是在对食源性疫情暴发的检测和监控方面起着至关重要的作用，相信全基因组测序在不久的将来在食品安全方面将发挥非常重要的作用。

何为全基因组测序？基因组携带着生物个体的遗传信息，基因组测序能够加深对生物个体分子机制的理解。所谓全，指把物种细胞里面完整的基因组序列从第1个DNA开始一直到最后一个DNA，完完整整地检测出来，并排列好，由此能够鉴定出基因组上任何类型的突变，包含着所有基因和生命特征之间的内在关联性。当然，全基因组测序的实现离不开更高的测序技术支撑。

测序技术，简单说来是将DNA中的信息转变为计算机可处理的数字信息。基因组测序技术作为人类探索生命奥秘的重要手段之一，对生命科学和生物医学等领域的发展起到了巨大的推动作用。

目前为止，测序技术可以分为三个阶段，或三代测序技术。

第一代测序技术以1977年出现的sanger测序技术为标志。一代技术的成本高，通量低，速度慢。

第二代测序技术以roche公司的454技术，illumina公司的solexa技术和ABI公司的solid技术的诞生为标志。与一代测序技术相比，二代测序技术不仅保持了高准确度，而且降低了测序成本，提高了测序速度。二代测序的出现，使得全基因组测序进入了新的纪元。

第三代测序技术紧随第二代测序技术出现，helicos和pacific公司推出了新的测序仪，与前2代技术相比，最大的特点是实现了单分子测序。该技术实现了对每一条DNA分子的单独测序，被认为是第三代测序技术的开启。

欧盟曾对传统细菌分离鉴定和全基因组测序分析进行过成本和时间的比较：使用传统生化和分型方法，要完成对于样本中细菌的分离鉴定、血清分型、耐药检测、分子分型等一系列检测，可能需要几天到几周的时间，总花费在360甚至1360欧元。而借助全基因组测序技术，从拿到菌株到得到全部信息，只需要1～2天的时间，并且其成本仅为50～100欧元。

因为对于传统生化和分型方法而言，不同的细菌需要有其特定的试剂、操作流程和方法;同时，准备工作繁琐、操作复杂，且细菌之间的比较仅能通过个别指标或基因位点来分析。对于全基因组测序，可允许几个病原体同时测序，从而使实验室操作更简单、更快、更便宜;同时，可利用细菌全基因组的特异性基因位点进行细菌间比对分析，极大提高特异性、灵敏度和分辨率，达到株水平的鉴定。

不难看出，全基因组测序能够将多个实验流程整合为一;是对传统技术的更進，也是代替;能够更精确地提供信息;且信息量更大，性价比更高。

鉴于全基因组测序的优点，全基因组测序数据的高度特异性能够改进病例定义，实现快速诊断;借助监视雷达，全基因组测序数据的高灵敏度可以将看似零星的散发病例相关联;通过遗传进化关系分析，全基因组测序对致病菌造成的食品污染、疾病爆发进行溯源分析，从而有效加强对疫情的管理。

全基因组测序的应用，是食品安全疫情监测与研究领域的重要一步。全基因组测序能够精确鉴定引起食源性疾病的菌株，将成为预防食源性疾病爆发的利器，在疾病暴发时可以更快地采取行动，鉴定致病微生物;同时，具备单核苷酸多态性分析，有助于理解目标生物体的进化史，提供细节供传染病学家们清楚地了解疾病的传播途径，揭示细菌暴发过程中发生的一系列小规模的基因突变，追踪暴发的源头，开展毒性特点和耐药性分析。

2014年4月-6月，英国借助全基因组测序实现沙门菌引起食源性疾病的原因食品溯源。当时，在欧盟各国暴发了350例沙门菌感染，通过流调发现，可能与使用生产商供应的鸡蛋制作的食品有关，于是英国在英格兰5家餐馆采集鸡蛋、环境样品、以及病人样品，同时与其他国家的沙门菌爆发菌株进行全基因组测序，发现这次暴发的菌株聚集成一簇，且菌株间突变很小，最后得出结论，欧盟各国350例沙门菌患者食用同一污染沙门菌鸡蛋。

在我国，全基因组测序在食品安全应用方面也有新的突破，发现了食源性碳青霉烯耐药沙门菌。国家食品安全风险评估中心作为国家食品安全风险监测、评估、预警和标准制定机构，从2002年开始就在全国范围内开展污染物和致病菌的风险监测和评估工作。一直以来非常关注食源性致病菌的耐药性问题，了解我国食源性沙门菌的NDM-1的流行情况。

2014年，国家食品安全风险评估中心微生物室在对山东某大型屠宰场采集屠宰后准备发货的整鸡样品的风险监测过程中，对141份样品进行沙门菌分离鉴定，后期抗生素药敏实验发现有1株印第安纳血清型的沙门菌，对测试的11类抗生素的全部21种抗生素耐药，仅对替加环素和多粘菌素敏感，可以说达到泛耐药的水平。随后用美罗培南Etest条进行确认，为碳青霉烯耐药沙门菌，同时PCR扩增发现菌株携带NDM-1基因，质粒传递性检测发现，其能够将质粒转移到大肠埃希氏菌中，转移频率在2.2× 10-4左右。

为了更深入地研究其耐药机制和毒力等特性，提取菌株的基因组DNA后进行了pacbio平台三代完成图测序。最后，对blaNDM-1耐药基因环境于NCBI中的菌株进行了比对，发现这株鸡肉来源的沙门菌NDM-1基因同其他多种耐药基因位于一个一类整合子上，两侧被IS26的插入元件包括，整合子、插入序列同质粒一样，都属于可移动元件，能都介导耐药基因在菌株间传递和转移。它同临床来源的大肠、弗氏柠檬酸杆菌和肺克具有高度同源性，提示，该基因环境可能已经在临床环境中发生传播。

这是我国屠宰后整鸡中blaNDM-1基因阳性印第安纳沙门菌首次报道。在监测工作过程中成功运用全基因组测序对食源性碳青霉烯耐药沙门菌的耐药机制进行了分析，发现菌株含有一个携带blaNDM-1基因等多重耐药基因的大质粒，鉴于该菌株表现为泛耐药（XDR），同时携带多种耐药基因、毒力因子和重金属抗性基因，一旦在环境、动物和消费者中传播，造成的潜在生态和健康危害将非常严重。同时，研究结果对加强肉鸡养殖、屠宰、运输、销售、消费等全食物链中多重耐药沙门菌的耐药监测，研究其传播机制，从而预防和控制多重耐药沙门菌，指导肉鸡养殖企业合理使用抗生素具有着重要意义。