急性胰腺炎患者血清lncR-MEG3的表达水平及临床意义

张云　陈文晓　张艳

[摘要] 目的 探討急性胰腺炎患者血清长链非编码RNA-MEG3（lncR-MEG3）的表达水平及其临床意义。 方法 收集2015年3月～2018年1月台州市第一人民医院（以下简称“我院”）收治的97例急性胰腺炎患者为病例组，并将其分为轻症急性胰腺炎患者（MAP组，n = 62）和重症急性胰腺炎患者（SAP组，n = 35），并随机选取我院同期30例健康体检者为对照组，采用实时荧光定量PCR法测定各组血清lncR-MEG3表达水平，并分析其与临床特征的关系及对急性胰腺炎病情严重程度的诊断价值。 结果 MAP组、SAP组患者血清lncR-MEG3表达水平低于对照组，且SAP组低于MAP组（P < 0.05）。改良的CT严重指数（MCTSI）评分≥4分、急性胰腺炎严重程度床边指数（BISAP）评分≥3分、Ranson评分≥3分，急性胰腺炎患者血清lncR-MEG3表达水平低于MCTSI评分<4分、BISAP评分<3分、Ranson评分<3分。ROC曲线下面积AUC评价血清lncR-MEG3对急性胰腺炎病情严重程度的诊断价值，结果显示，AUC为0.805，95%CI（0.720，0.891），lncR-MEG3最佳截断值为3.67，此时灵敏度、特异性分别为0.79，0.85，准确性为0.82。 结论 血清lncR-MEG3通过表达下调参与急性胰腺炎发病过程，其与病情严重程度密切相关，早期检测可作为评估急性胰腺炎病情严重程度的重要标志物。

[关键词] 轻症急性胰腺炎;重症急性胰腺炎;长链非编码RNA-MEG3;诊断价值

[中图分类号] R567          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）06（b）-0113-05

Expression level and clinical significance of serum lncR-MEG3 in patients with acute pancreatitis

ZHANG Yun   CHEN Wenxiao   ZHANG Yan

Department of Gastroenterology， Taizhou First People′s Hospital， Zhejiang Province， Taizhou   318020， China

[Abstract] Objective To investigate the expression level and clinical significance of long non-coding RNA-MEG3 （lncR-MEG3） in serum of patients with acute pancreatitis. Methods Form March 2015 to January 2018， 97 cases of patients in Taizhou First People′s Hospital （"our hospital" for short） with acute pancreatitis were sollected as treated group， and it can be divided into patients with mild acute pancreatitis （MAP group， n = 62） and patients with severe acute pancreatitis （SAP group， n = 35）， and from the same period were randomly selected 30 cases of healthy check-up for a control， using real-time fluorescent quantitative PCR method established groups of serum lncR-MEG3 expression level， and analyze its relationship with the clinical features and diagnostic value of illness severity of acute pancreatitis. Results The expression levels of lncR-MEG3 in serum of patients in MAP group and SAP group were lower than those in the control group， and those in SAP group were lower than those in MAP group （P < 0.05）. The improved CT severity index （MCTSI） score ≥4 points， bedside Acute pancreatitis severity bedside index （BISAP） score ≥3 points， Ranson score ≥3 points， and serum lncR-MEG3 expression levels in patients with acute pancreatitis were lower than MCTSI score< 4 points， BISAP score < 3 points， and Ranson score< 3 points. The curve area （AUC） under ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of serum lncR-MEG3 for the severity of acute pancreatitis. The results showed that the AUC was 0.805， 95%CI （0.720， 0.891）， and the optimal cut-off value of lncR-MEG3 was 3.67， and the sensitivity and specificity were 0.79， 0.85， and accuracy was 0.82， respectively. Conclusion Serum lncR-MEG3 is involved in the pathogenesis of acute pancreatitis through down-regulation of its expression， which is closely related to the severity of acute pancreatitis. Early detection can be used as an important marker to evaluate the severity of acute pancreatitis.

[Key words] Mild acute pancreatitis; Severe acute pancreatitis; Long non-coding RNA MEG3; Prognostic value

急性胰腺炎是临床常见的内科急腹症，是指由多种病因引起胰腺内胰酶被激活而致胰腺的局部炎性反应，常伴有不同程度其他器官功能改变，主要包括轻症急性胰腺炎（MAP）和重症急性胰腺炎（SAP）[1-2]。研究[3]表明，轻症急性胰腺炎多为自限性，预后较好，但如果治疗不及時，有20%～25%可进展为重症急性胰腺炎，病情凶险，病死率可高达30%～50%。目前临床常结合临床症状和体征、影像学检查诊断急性胰腺炎，但是缺乏特异性，可能会造成误诊和漏诊，延误治疗时机。寻找灵敏度高、特异性好的分子标志物辅助临床诊断急性胰腺炎并评估病情严重程度，对及时制订针对性干预措施具有重要意义。长链非编码RNA（lncRNA）是一类非编码蛋白质的RNA分子，长度为200～100 000个核苷酸，可调控细胞生长、发育等生理活动，以及参与多种疾病的发生、发展过程[4]。母系表达基因（MEG3）是具有肿瘤抑制功能的lncRNA，研究显示[5-7]，MEG3表达下调参与了乳腺癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤的发生发展过程。本研究通过检测血清lncR-MEG3表达水平，旨在探讨其在急性胰腺炎发病过程中的作用。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年3月～2018年1月浙江省台州市第一人民医院（以下简称“我院”）收治的97例急性胰腺炎患者为病例组，纳入标准：（1）符合《中国急性胰腺炎诊治指南》中急性胰腺炎诊断标准[8]，符合以下至少2项特征：①急性、突发、持续且剧烈的上腹部疼痛，且疼痛向背部放射;②血清淀粉酶、脂肪酶活性两者至少有1项较正常值上限的3倍高;③腹部超声，或者增强CT/MRI检查结果提示急性胰腺炎。排除标准：①妊娠期以及哺乳期妇女;②心脏功能不全者;③肝、肾功能障碍者;④急、慢性炎症性反应患者;⑤自身免疫性疾病患者;⑥恶性肿瘤患者;⑦合并其他可能影响本研究结果的疾病。根据《2012版急性胰腺炎分类：亚特兰大国际共识的基线胰腺炎分类和定义的修订》[9]，将患者分为轻症急性胰腺炎患者（SAP组）和重症急性胰腺炎患者（MAP组）。SAP组62例，男37例，女25例;年龄37～69岁，平均（44.7±11.2）岁。MAP组35例，男22例，女13例;年龄35～71岁，平均（42.6±12.0）岁。于同期随机选取我院30名健康体检者为对照组，男19名，女11名;年龄37～66岁，平均（43.0±11.6）岁。三组性别构成、年龄比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会的审批通过，研究对象及家属在知情同意书上签字。

1.2 方法

1.2.1 lncR-MEG3检测  抽取各组研究对象清晨空腹外周静脉血5 mL，采用EDTA抗凝，以2000 r/min的速度离心10 min，离心半径为8 cm，收集上清液，置于无菌冻存管中，保存于液氮中，备用。采用Trizol试剂盒（Invitrogen公司提供，生产批号：20141009）提出血清中RNA，严格按照RT反转录试剂盒（美国GeneCopoeia公司提供，生产批号：20132207）的说明将RNA反转录为cDNA。lncR-MEG3上游引物序列为：5′-TCGCTCTTCTCCATCGAACCG-3′，下游引物序列为：5′-GTAGGGCGACGACTTTGAGT-3′，引物由广州锐博生物技术有限公司提供，引物长度为22 bp;内参基因上游引物序列为：5′-ATGGTGAAGGTCGGTGTGA-3′，下游引物序列为：5′-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAG-3′，引物长度18 bp。反转录反应体系为20 μL，分别4 μL的5×PrimeScript Buffer，1 μL的PrimeScript RT Enzyme Mix，1 μL浓度为50 μmol/L的Oligo dT Primer，1 μL浓度为100 μmol/L的Random 6mers，1 μg总RNA，加H2O至20 μL，反转录条件：16℃ 20 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。采用实时荧光定量PCR法测定血清lncR-MEG3表达水平，严格按照PCR试剂盒（美国GeneCopoeia公司提供，生产批号：20141618）进行扩增，扩增反应体系为20 μL，分别为10 μL的2×All-in-one qPCR Mix，0.4 μL的50×ROX Reference Dye，5.6 μL的ddH2O，1 μL的GAPDH引物Mix，1 μL的lncR-MEG3引物Mix，2 μL的cDNA template，反应条件：95℃预变性10 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共进行45个循环。lncR-MEG3的相对表达量采用2-△△Ct表示。

1.2.2 急性胰腺炎病情严重程度评估  ①改良的CT严重指数（MCTSI）评分[10]，包括胰腺炎性反应和胰腺坏死两部分;胰腺炎性反应中正常胰腺记为0分，胰腺和/或胰周炎性改变记为2分，单发或多个积液区或胰周脂肪坏死记为4分;胰腺坏死中无胰腺坏死记为0分，坏死范围≤30%记为2分，坏死范围>30%记为4分，胰外并发症如胸腔积液、腹水、胃肠道或血管受累记为2分。胰腺炎性反应与坏死评分之和即为MCTSI评分。MCTSI评分<4分记为轻症急性胰腺炎，MCTSI评分≥4分记为重症急性胰腺炎。②急性胰腺炎严重程度床边指数（BISAP）评分[11]，包括血尿素氮、受损的精神状态、全身炎症反应综合征、年龄以及胸腔积液共5项内容：血尿素氮≤25 mg/dL记为0分，>25 mg/dL记为1分;受损的精神状态=15分记为0分， <15分记为1分;全身炎症反应综合征内容1项及以下记为0分，超过1项记为1分;年龄≤60岁记为0分，>60分记为1分;无胸腔积液记为0分，有胸腔积液记为1分，总分<3分记为轻症急性胰腺炎，总分≥分记为重症急性胰腺炎。③Ranson评分[12]：包括入院时5项临床指标以及48 h时6项指标，每项指标均记为1分，总分<3分记为轻症急性胰腺炎，总分 ≥3分记为重症急性胰腺炎。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件录入及统计分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组独立样本的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验;计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验，采用ROC曲线下面积（AUC）评价lncR-MEG3对急性胰腺炎病情的诊断价值。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清lncR-MEG3表达水平比较

三组血清lncR-MEG3表达水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05），MAP组、SAP组患者血清lncR-MEG3表达水平低于对照组，且SAP组患者血清lncR-MEG3表达水平低于MAP组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1、图1。

MAP：轻症急性胰腺炎;SAP：重症急性胰腺炎

2.2 急性胰腺炎患者临床特征与血清lncR-MEG3表达的关系

不同MCTSI评分、BISAP评分、Ranson评分急性胰腺炎患者血清lncR-MEG3表达水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05），MCTSI评分≥4分、BISAP评分≥3分、Ranson评分≥3分急性胰腺炎患者血清lncR-MEG3表达水平低于MCTSI评分<4分、BISAP评分<3分、Ranson评分<3分患者。见表2。

2.3 血清lncR-MEG3对急性胰腺炎病情的诊断价值

采用ROC曲线下面积AUC评价血清lncR-MEG3对急性胰腺炎病情严重程度的诊断价值，结果显示，AUC为0.805，95%CI（0.720，0.891），lncR-MEG3的最佳截断值为3.67，此时的灵敏度、特异性分别为0.79、0.85，准确性为0.82。见图1。

3 讨论

急性胰腺炎病情危重，治疗不及时可导致代谢性酸中毒、多器官功能衰竭、休克等，病死率较高，严重威胁患者的健康和生命质量[13-15]。目前临床主要根据急性胰腺炎临床表现包括麻痹性肠梗阻、腹膜炎体征等，结合B超或者CT显示胰腺肿大，以及血液学指标如淀粉酶、酯酶升高等进行诊断。但是报道[2，16]显示，肠梗阻、急性阑尾炎患者也存在淀粉酶及酯酶升高现象，因此血液学指标用于诊断急性胰腺炎的特异性差。寻找灵敏度高、特异性好的生物标志物辅助临床早期诊断急性胰腺炎，并评估病情严重程度，对改善患者预后有重要价值。lncRNA是一类长度超过200 nt的无编码蛋白质功能的RNA，研究[17]表明，lncRNA与神经退行性疾病、风湿免疫性疾病、恶性肿瘤等多种疾病密切相关，MEG3是在卵巢、脑、垂体等正常组织中高表达的lncRNA，MEG3表达异常与多种疾病的发生、发展密切相关。Su等[18]研究显示，lncR-MEG3表达下调通过介导血管生成而参与骨关节炎的发生发展过程。Xu等[19]研究显示，将糖尿病小鼠模型视网膜中lncR-MEG3基因敲除，可加重毛细血管退变，增加微血管通透性和炎性反应。研究[20-21]显示，MEG3表达下调能促进结直肠癌、胃癌等恶性肿瘤细胞的增殖、生长，并抑制其凋亡。关于lncR-MEG3在急性胰腺炎中的发病作用，目前相关的研究相对较少。

本研究结果显示，急性胰腺炎患者血清lncR-MEG3表达水平低于健康体检者，并且SAP患者血清lncR-MEG3表达水平低于MAP患者，提示lncR-MEG3表达下调参与了急性胰腺炎的发病过程，并且与病情严重程度密切相关。研究[22]发现，lncR-MEG3参与恶性肿瘤发病的机制为：lncR-MEG3使机体内P53蛋白含量增加，并与GDF15启动子结合而增加GDF15的表达，以影响癌细胞的增殖、分化能力来调节疾病的发生、发展，lncR-MEG3在急性胰腺炎发病中的机制是否与此有关，仍需进一步的研究。MCTSI、BISAP、Ranson评分是临床评价急性胰腺炎病情严重程度的重要指标，评分越高，病情越危重。本研究中，较MCTSI评分<4分、BISAP评分<3分、Ranson评分<3分急性胰腺炎患者而言，MCTSI评分≥4分、BISAP评分≥3分、Ranson评分≥3分的患者血清lncR-MEG3表达水平更高，提示lncR-MEG3可作为潜在区分急性胰腺炎病情严重程度的生物学指标，评分越高的患者，lncR-MEG3表达水平越低。采用ROC曲线下面积（AUC）评价血清lncR-MEG3对MAP和SAP的诊断价值，结果显示，AUC为0.805，lncR-MEG3最佳截断值为3.67，此时的灵敏度和特异性分别为0.79和0.85，准确性为0.82。提示lncR-MEG3可作为临床辅助诊断急性胰腺炎病情严重程度的指标，临床有重要参考价值。

综上所述，lncR-MEG3通过低表达而参与急性胰腺炎的发病过程，并与病情严重程度密切相关，早期检测可作为临床辅助诊断急性胰腺炎病情严重程度的重要标志物。

[参考文献]

[1]  孙昀.重症急性胰腺炎早期液体治疗策略[J].肝胆外科杂志，2017，25（6）：475-476.

[2]  王春全，陈景祥，杨进军，等.miR-216a在急性胰腺炎患者外周血的表达及临床意义[J].免疫学杂志，2013，29（1）：47-49.

[3]  张旭，付强，秦涛，等.急性胰腺炎患者血清长链非编码RNA-MEG3表达及意义[J].中华实用诊断与治疗杂志，2018，32（1）：28-30.

[4]  魯艳明，黄翠艳，王月，等.长链非编码RNA在妇科恶性肿瘤中研究进展[J].中华肿瘤防治杂志，2017，24（24）：1751-1756.

[5]  陈锐沛，吴灵飞.长链非编码RNA母系表达基因3与肿瘤发生的研究进展[J].汕头大学医学院学报，2016，29（1）：59-61，64.

[6]  胡强，许斌，陈明.长链非编码RNA母系表达基因3在肿瘤中表达的研究现状[J].东南大学学报，2017，36（3）：482-485.

[7]  李剑琦.长链非编码RNA MEG3对上皮性卵巢癌细胞增殖的影响及其作用机制的研究[D].广州：广州医科大学，2014.

[8]  中华医学会消化病学分会胰腺疾病学组，中华胰腺病杂志编辑委员会，中华消化杂志编辑委员会.中国急性胰腺炎诊治指南（2013，上海）[J].中华胰腺病杂志，2013， 3（2）：217-222.

[9]  李能平.《2012版急性胰腺炎分类：亚特兰大国际共识的分类和定义的修订》解读[J].中华胰腺病杂志，2013， 13（3）：148-151.

[10]  Sahu B，Abbey P，Anand R，et al. Severity assessment of acute pancreatitis using CT severity index and modified CT severity index：Correlation with clinical outcomes and severity grading as per the Revised Atlanta Classification [J]. Indian J Radiol Imaging，2017，27（2）：152-160.

[11]  Ye JF，Zhao YX，Ju J，et al. Building and verifying a severity prediction model of acute pancreatitis （AP） based on BISAP，MEWS and routine test indexes [J]. Clin Res Hepatol Gastroenterol，2017，41（5）：585-591.

[12]  Ustunda GY，Sarξ U. C-Reactive Protein Levels Together with the Ranson Scoring System to Differentiate the Mild and Severe Forms of Acute Pancreatitis [J]. Turk J Gastroenterol，2017，28（3）：157-158.

[13]  冀凤霞.观察急性胰腺炎的循证护理的临床疗效[J].世界最新医学信息文摘，2016，16（61）：370，372.

[14]  李非.急性胰腺炎外科干预的时机及技术探讨[J].临床肝胆病杂志，2017，33（1）：32-35.

[15]  朱美冬，罗运权.中西医治疗重症急性胰腺炎的研究进展[J].临床肝胆病杂志，2017，33（1）：188-193.

[16]  牛凯，成宇晶.淀粉酶升高的非胰腺炎腹痛36例临床分析[J].山西医药杂志，2011，40（4）;380-381.

[17]  孟菲菲，司君利，解祥军，等.长链非编码RNAs MEG3和GAS5在胃癌组织中的表达及其与预后的关系[J].中国临床研究，2016，29（11）：1449-1452，1457.

[18]  Su W，Xie W，Shang Q. The long non-coding RNA MEG3 is down-regulated and inversely associated with VEGF levels in osteoarthritis [J]. Biomed Res Int，2015：356893.

[19]  Xu Z，Yan Y，Qian L，et al. Long non-coding RNAs act as regulators of cell autophagy in diseases（Review）[J]. Oncol Rep，2017，37（3）：1359-1366.

[20]  赵月鸣，邹玉凤，董莹，等.母系印迹表达基因3在结直肠癌组织中表达及其与血管生成的关系[J].中国普通外科杂志，2016，25（10）：1450-1454.

[21]  张麒，艾良，代佑果.長链非编码RNA母系表达基因3多态性与胃癌关系的研究[J].中国普外基础与临床杂志，2018（11）：1323-1326.

[22]  陈锐沛，吴灵飞.长链非编码RNA母系表达基因3与肿瘤发生的研究进展[J].汕头大学医学院学报，2016， 29（1）：59-61，64.