海藻糖和甘露醇对冻融循环引起的虾蛄肌原纤维蛋白结构和功能特性变化的影响

陈金玉，李 彬，何丽丽，梁唤唤，韦英霞，韩业勤，张坤生*

（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134）

冷冻贮藏是原料肉和肉制品保鲜贮藏的主要方式。在低温条件下微生物和酶活性受到抑制，但是肌肉品质的劣变仍然无法避免。尤其目前我国冷链技术尚不完善，在肉品的长途运输、贮藏及消费过程中，由于温度波动不可避免地出现反复冻融现象。肉在反复冻融过程中会发生肉质硬化、柔软性下降、持水力降低、组织纤维化等变化，产生这些现象的根本原因是肌原纤维蛋白的变性[1]。肌原纤维蛋白是由肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白、肌钙蛋白、辅肌动蛋白等所组成的盐溶性蛋白。反复冻融使样品中小冰晶体重结晶，从而在肌原纤维中重新分布，导致细胞结构被破坏，肌原纤维蛋白变性，降低肉产品的食用价值[2]。因此研究反复冻融对肌肉品质的影响以及控制肉蛋白冷冻变性具有重要的现实意义。

冷冻变性保护剂又称抗冻剂，是目前防止蛋白冷冻变性的最主要方法。保护剂的种类很多，蔗糖因其价格低廉、抗冻效果较好且不易发生美拉德反应而广泛应用于生产中，但此类抗冻剂甜度和热量相对较高，与当前人们对健康饮食的追求不太相符，因此低甜度、低热量的抗冻剂成为新的研究对象。目前海藻糖和甘露醇作为低热量功能性糖醇类抗冻剂受到越来越多关注。Sei等[3]发现海藻糖在抑制冰晶增长和冰晶形态不稳定方面，比蔗糖更具优势。薛勇等[4]采用10%海藻糖作为抗冻剂，测定冻藏后鳙鱼肌原纤维蛋白性质的变化，结果表明海藻糖的抗冷冻效果优于蔗糖和山梨醇混合物。然而，目前关于海藻糖和甘露醇复配对反复冻融引起的肌原纤维蛋白氧化变性的影响还鲜有报道。

在众多肉类食品中，虾蛄（Oratosquilla oratoria）作为一种营养丰富、肉质鲜美的海产品，深受消费者喜爱。虾蛄收获的季节性非常强，为便于保鲜，常采用低温贮存。在贮藏加工过程中，虾蛄肉品质的变化直接影响其消费价值，其中肌原纤维蛋白对虾蛄产品的保水性、质地等品质都起着决定性作用。因此，本实验以虾蛄为对象，研究反复冻融处理对肌原纤维蛋白氧化、结构和功能特性的影响，探索冻融循环对虾蛄蛋白品质的影响规律。在此基础上，探讨4 g/100 mL海藻糖＋4 g/100 mL甘露醇抗冻剂对虾蛄肌原纤维蛋白的冷冻保护作用和机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用口虾蛄捕自渤海湾（天津）近海海域，购于天津市北辰区老板娘水产城。

海藻糖、甘露醇、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenyl hydrazine，DNPH）、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯 上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Avanti J-E高效冷冻离心机 美国Beckman公司；U5100紫外-可见分光光度计、F-4600荧光分光光度仪、SU3500扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；Physica MCR301高级旋转流变仪 奥地利Anton Paar公司；TA.XT Plus质构仪 英国Stable Micro System公司；POLYTRON PT 2100匀浆机 瑞士Kinematica公司。

1.3 方法

1.3.1 冻融循环处理

虾蛄去头、尾，剥壳，取肉剁碎。将虾蛄肉糜分为两份，每份1 000 g，一份为对照组，一份为实验组。将实验组肉糜浸泡在冷冻保护剂溶液中2 h，然后将沥干的肉糜样品（约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）放入聚乙烯自封袋中（5 份，每份200 g，分别编号为实验1、2、3、4、5组）。对照组做同样的分组处理。将对照组和实验组样品置于－20 ℃冰箱中冷冻，5 d后取出，室温解冻至其中心温度为0 ℃，然后放回－20 ℃冰箱中贮藏，此为一个冻融处理。从5 组样品中随机抽取3 份进行各项指标的测定，然后将剩余样品放回－20 ℃继续冷冻5 d。依此方法分别进行0、1、3、5 次冻融处理，并进行相应的指标测定。考虑到目前工业上采用的商业抗冻剂为4%蔗糖＋4%山梨糖醇，因此本实验选择4 g/100 mL海藻糖＋4 g/100 mL甘露醇为冷冻保护剂溶液。

1.3.2 肌原纤维蛋白提取

参考Park等[5]的方法。向肉糜中加入4 倍体积蛋白提取液（0.1 mol/L NaCl、0.002 mol/L MgCl2、0.001 mol/L EDTA-2Na、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0），11 000 r/min匀浆25 s，4 ℃、5 000 r/min离心15 min，弃上清液，留沉淀，再加入蛋白提取液重复上述操作2 次得粗蛋白。将所得粗蛋白与4 倍体积0.1 mol/L NaCl溶液混合，匀浆25 s，4 ℃、5 000 r/min离心15 min，弃上清液，留沉淀，再加入NaCl溶液重复上述操作2 次即得虾蛄肌原纤维蛋白。采用双缩脲法测定蛋白质浓度，以牛血清蛋白为标准品。

1.3.3 冻融循环对虾蛄肌原纤维蛋白氧化及结构的影响

1.3.3.1 羰基含量测定

采用DNPH法测定蛋白羰基含量[6]。取0.5 mL蛋白溶液（5 mg/mL）于离心管中，加入1 mL 10 mmol/L DNPH（溶于2 mol/L盐酸），室温避光反应1 h，每隔10 min涡旋一次，然后加入等体积20%三氯乙酸溶液，5 000 r/min离心10 min，弃上清液，所得沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）充分洗涤3 次，以除去未反应的DNPH。加入4 mL盐酸胍溶液（6 mol/L，溶于20 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 6.5），37 ℃溶解沉淀20 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液于370 nm波长比色。羰基含量根据摩尔消光系数22 000 L/（mol•cm）计算。空白对照组加入1 mL 2 mol/L盐酸（不含DNPH），其余步骤同上。

1.3.3.2 总巯基含量测定

蛋白巯基含量通过DTNB法测定[7]。肌原纤维蛋白（5 mg/mL）溶解于含5%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）的Tris缓冲液（0.1 mol/L，pH 8.0），80 ℃水浴45 min，8 000 r/min离心10 min。收集上清液用于巯基含量的测定。用相同缓冲液配制10 mmol/L DTNB。取0.5 mL上清液与2 mL 5% SDS/Tris缓冲液混合，随后加入0.2 mL DTNB避光反应30 min，混合液于波长412 nm测定吸光度。空白以5% SDS/Tris缓冲液替代蛋白样品。采用摩尔消光系数13 600 L/（mol•cm）计算总巯基含量。

1.3.3.3 表面疏水性测定

参考Chelh等[8]的方法。向1 mL肌原纤维蛋白分散液（5 mg/mL）中加入200 μL 1 mg/mL溴酚蓝（bromophenol blue，BPB）（去离子水溶解）。空白组用20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）替代。室温下充分振荡10 min，5 000 r/min离心15 min。取上清液稀释10 倍后在595 nm波长处测吸光度A。疏水性用BPB结合量表示，计算如式（1）所示：

1.3.3.4 内源性色氨酸荧光强度测定

色氨酸荧光强度的变化通过F-4600荧光分光光度仪进行检测。用0.5 mol/L NaCl溶液将蛋白稀释为质量浓度0.04 mg/mL，室温条件下于295 nm波长处激发，记录下310～400 nm波长处发射光谱供后续分析。扣除溶剂发射光谱（在相同条件下获得）以排除干扰。

1.3.4 冻融循环对虾蛄肌原纤维蛋白凝胶性能的影响

1.3.4.1 动态流变测试

根据Li Chunqiang等[9]的方法。将20 mg/mL蛋白样品（分散于0.5 mol/L NaCl）置于离心管内，于4 ℃离心1 min脱气。将脱气后的蛋白均匀涂布于流变仪的下平板上，将上平板降至1 mm时用柔软的实验用纸轻轻擦去周围多余的样品，并在边缘涂上硅油以防加热过程中水分流失。在振荡模式下以1 ℃/min的升温速率加热样品，记录20～80 ℃的升温曲线。设置振荡频率为0.1 Hz，控制最大应力为0.02。凝胶性能通过储存模量（G’）进行评价。

1.3.4.2 凝胶强度及持水力测定

将蛋白质量浓度调整为40 mg/mL，取20 mL于平底玻璃瓶中，加盖密封，水浴加热。具体升温程序如下：起始温度20 ℃，以1 ℃/min线性升温至73 ℃。加热结束后，立即将样品放入冰水混合物中冷却30 min，然后置于4 ℃冰箱过夜。在测定凝胶性能之前，将凝胶样品从4 ℃取出放在室温下平衡2 h。利用质构仪测定凝胶强度，选用P0.5圆柱探头，测试全过程设定探头速率均为1 mm/s，凝胶强度定义为破坏凝胶结构需要的初始力。

凝胶持水力通过离心的方法测定。将一定质量凝胶于4 ℃、6 000 r/min离心15 min，记录离心管（m）以及离心前后的总质量分别为m1和m2。持水力的计算如式（2）所示：

1.3.4.3 扫描电子显微镜观测凝胶微观结构

用0.1 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制2.5%戊二醛溶液固定凝胶样品12 h，从而获得样品块（3 mm×3 mm×3 mm）。然后用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）洗涤3 次，在30%、50%、70%、90%、95%和100%乙醇溶液中梯度脱水。最后将样品冷冻干燥后即可进行电子显微镜扫描。

1.3.5 冻融循环对虾蛄肌原纤维蛋白乳化特性的影响

将8 mL 1 mg/mL的蛋白溶液与2.0 mL大豆油混合，15 000 r/min匀浆1 min，分别在第0、10分钟时在距离心管底部0.5 cm处取100 μL匀浆液，加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，混匀，以0.1% SDS为空白，500 nm波长处测定吸光度。蛋白乳化活性及乳化稳定性由式（3）、（4）计算：

式中：A500nm为500 nm波长处的吸光度；n为稀释倍数；C为蛋白质量浓度/（mg/mL）；φ为乳化液中油的体积分数/%；A0和A10分别为第0、10分钟时500 nm波长处吸光度。

1.4 统计学分析

2 结果与分析

2.1 冻融循环对虾蛄肌原纤维蛋白氧化及结构的影响

2.1.1 蛋白羰基

蛋白羰基侧链含—NH—或—NH2的氨基酸非常容易受到活性氧（reactive oxygen species，ROS）的氧化攻击而转化为羰基。因此，蛋白羰基含量的变化是目前最为广泛用于衡量蛋白质氧化程度的指标。蛋白羰基产生途径主要包括：氨基酸侧链的氧化、肽键的断裂、外源性羰基的引入（脂肪氧化产物中的醛类以及酚类物质的氧化产物半醌或醌类共价链接到蛋白侧链）。一般来说，羰基含量越高表明蛋白氧化程度越高。经不同冻融次数处理后的虾蛄肌原纤维蛋白羰基含量的变化如图1所示。未经冻融处理的对照组和实验组的蛋白羰基含量无差异，这说明冷冻保护剂海藻糖和甘露醇对肌原纤维蛋白羰基含量没有影响。在进行1、3、5 次冻融处理后，蛋白发生不同程度的氧化变性，表现为羰基含量显著上升，尤其在反复冻融5 次后较未经冻融的蛋白羰基含量增加了47.4%（P＜0.05）。这与姜晴晴等[2]的研究结果一致。海藻糖和甘露醇的添加有效抑制了氧化诱导的羰基含量上升：其抑制效率在5.2%～14.4%之间。在冷冻过程中，虾蛄肉中的水分部分冻结导致细胞内外溶质浓度增加，同时，冰晶生长的物理效应会破坏肌肉细胞，导致线粒体和溶酶体酶等渗入肌浆中，从而加速蛋白、脂肪的氧化反应[10]。冷冻保护剂如蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇等可以降低肉品的冰点[11]，而且，海藻糖和甘露醇等可以与蛋白质分子的功能基团通过氢键或离子键相结合，这样每个蛋白质分子都被冷冻保护剂分子所包覆，降低了因反复冻融引发的冻结和氧化伤害[12]。

图1 冻融处理对肌原纤维蛋白羰基含量的影响Fig. 1 Effects of freeze-thaw cycles on carbonyl content of myofibrillar protein

2.1.2 总巯基含量

肌原纤维蛋白主要由肌球蛋白和肌动蛋白组成，肌球蛋白约占其总量的43%，每分子含有40 个巯基，不含二硫键；肌动蛋白约占22%，每分子含有5 个巯基，也不含二硫键。巯基易受自由基攻击而转化成二硫键。因此，巯基含量的减少以及二硫键的形成是蛋白氧化的重要前期指标之一。由图2可知，冻融处理对肌原纤维蛋白巯基含量的影响与羰基变化趋势恰好相反。未经冻融处理的蛋白总巯基含量约为（44.26±0.74）nmol/mg，冻融处理1、3、5 次后，巯基含量分别下降了12.7%、17.7%、37.6%。这与Benjskul等[13]在大西洋白鳕冰藏过程中得到的研究结果相似。反观实验组，经1、3、5 次冻融处理后，蛋白巯基含量分别下降了6.2%、9.6%、25.5%，4 g/100 mL海藻糖＋4 g/100 mL甘露醇显著抑制了蛋白巯基含量的减少。在冻藏过程中肌原纤维蛋白巯基含量的下降可能是由于水形成冰结晶后，破坏肌原纤维蛋白的空间结构，使巯基暴露出来，进而被氧化成二硫键使巯基含量下降。Hamre等[14]同样发现，大眼海鱼在－18 ℃冷藏时总巯基含量随冷藏时间延长而下降，而二硫键含量却上升。海藻糖和甘露醇等冷冻保护剂作为蛋白质分子的防护屏障，能阻止肌肉中各种促氧化成分如自由基等对蛋白分子的攻击，从而有效抑制蛋白巯基向二硫键的氧化转化[15]。Li Yanqing等[16]研究发现蔗糖和山梨糖醇对冻藏6 个月后的鱼糜蛋白总巯基含量也有显著的保护作用。Zhou Aimei[17]和Etemadian[18]等也得到了类似的结论。

图2 冻融处理对肌原纤维蛋白总巯基含量的影响Fig. 2 Effects of freeze-thaw cycles on total sulfhydryl content of myofibrillar protein

2.1.3 表面疏水性

BPB可以结合于蛋白质分子表面的疏水性位点，因此蛋白质所能结合的BPB量可被用作反应蛋白表面疏水性的指标[8]。一般来说，表面疏水性增加是蛋白质分子结构展开的一个重要指标。氧化导致蛋白结构展开，暴露出更多的疏水性氨基酸残基使得蛋白表面疏水性增强。如图3所示，与未经冻融处理的蛋白样品相比，经1、3、5 次冻融处理的蛋白所结合的BPB量明显上升，尤其是在5 次冻融循环后表面疏水性增加了1.48 倍，说明反复冻融导致肌原纤维蛋白结构展开、疏水性上升。这可能是因为冻融处理导致蛋白质氧化程度加深，表现为蛋白羰基化、肽主链的断裂以及分子间二硫键的形成，蛋白质解折叠，一些疏水性的脂肪族与芳香族氨基酸侧链基团从蛋白分子内部暴露，从而引起表面疏水性的增加[2,19]。海藻糖和甘露醇的添加对蛋白表面疏水性上升具有显著的抑制作用，抑制率分别为10.7%（1 次冻融）、23.2%（3 次冻融）、19.6%（5 次冻融）。Herrera等[20]研究表明冷冻保护剂能减少非极性氨基酸侧链基团的暴露，从而降低蛋白的表面疏水残基数量，阻止蛋白分子因疏水相互作用引发的过度聚集。

图3 冻融处理对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响Fig. 3 Effects of freeze-thaw cycles on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

2.1.4 内源色氨酸荧光

蛋白质内源性色氨酸荧光对于其周边微环境的极性非常敏感。当蛋白质处于折叠状态时，色氨酸残基主要位于蛋白质内核这样的疏水环境中，此时被激发的色氨酸具有相对较高的荧光强度；当蛋白质部分或者完全展开时，色氨酸残基就会更多的暴露于蛋白质分子表面，此时被激发的色氨酸荧光强度降低。因此，内源性色氨酸荧光特性常被用于蛋白三级结构的检测[21]。如图4所示，随着冻融处理次数的增加，肌原纤维蛋白的荧光强度显著下降，这表明蛋白三级结构的展开。反复冻融破坏了肌原纤维蛋白天然的排列方式，蛋白展开变性使得原本位于内部的色氨酸残基暴露于表面而处于溶剂的极性环境中，从而引起内源荧光强度下降。添加海藻糖和甘露醇使荧光强度有不同程度回升，说明在二者的保护作用下，蛋白分子变性程度较低，结构变化相对较小，色氨酸残基暴露少，这与上述表面疏水性结果相吻合。

图4 冻融处理对肌原纤维蛋白内源色氨酸荧光强度的影响Fig. 4 Effects of freeze-thaw cycles on tryptophan fl uorescence intensity of myofibrillar protein

2.2 冻融处理对虾蛄肌原纤维蛋白凝胶性能的影响

2.2.1 动态流变特性

图5 冻融循环对肌原纤维蛋白在热凝胶过程中弹性G’的影响Fig. 5 Effects of freeze-thaw cycles on storage modulus (G’) of myo fi brillar protein during thermal gelation

如图5所示，未经冻融的蛋白在加热过程中出现两个典型的流变转变峰，其峰值分别在44 ℃和50 ℃左右，第1个峰的出现可归因于肌球蛋白头部变性及交联，第2个峰应是肌球蛋白尾部解旋并聚集的结果。在加热早期阶段，肌球蛋白的聚集主要是涉及二硫键交换的头部-头部结合，在随后的加热过程中是部分不可逆的尾部解螺旋及尾部-尾部交联，紧接着就是三维凝胶网络的形成[22]。

经1、3、5 次冻融循环后，肌原纤维蛋白G′在第1个峰值处急剧下降，较未冻融蛋白分别下降了14.6%、70.4%、86.7%，且最终G′值也随着冻融次数的增加而显著下降，这说明3 次及以上冻融循环严重破坏了肌原纤维蛋白的凝胶性能。此外，经冻融处理的蛋白G′的起始上升温度与转变峰的温度较未冻融蛋白均有所提前，可能由于反复冻融破坏了蛋白结构，使得埋藏于蛋白分子内部的活性官能团暴露出来，从而加强了蛋白之间的相互作用[23]。海藻糖和甘露醇的添加显著提高了蛋白在加热过程中的G′，尤其在3、5 次冻融循环后，第1个转变峰值较对照组分别提高了1 倍和2.8 倍。反复冻融导致肌原纤维蛋白变性，结构过度展开，蛋白聚集沉淀，活性功能基团被屏蔽，从而破坏蛋白凝胶性能。海藻糖和甘露醇等冷冻保护剂能与蛋白在连续相中相互作用，从而产生具有黏弹性的非晶态网络结构[24]。Li Xingke等[25]的研究得到与本实验类似的结论，他们发现壳聚糖对鲢鱼盐溶蛋白的凝胶性能同样有促进作用。

2.2.2 凝胶强度及持水力

图6 冻融循环对肌原纤维蛋白凝胶强度（A）和持水力（B）的影响Fig. 6 Effects of freeze-thaw cycles on gel strength (A) and waterholding capacity (B) of myofibrillar protein

如图6所示，虾蛄肌原纤维蛋白的热诱导凝胶强度随着冻融次数的增加显著下降（P＜0.05），蛋白经1、3、5 次冻融循环处理后其凝胶强度较未冻融蛋白分别下降了20.2%、39.7%、56.4%。Erikson等[26]也发现冻藏会显著降低三文鱼里脊肌原纤维蛋白的凝胶硬度。4 g/100 mL海藻糖＋4 g/100 mL甘露醇则可以有效抑制蛋白凝胶强度的下降，抑制效率在11.2%～33.6%之间。冻融循环导致虾蛄肌球蛋白和肌动球蛋白变性，以致于在随后的热处理过程中无法形成致密的凝胶网络结构[27]，因此得到较低的凝胶强度。海藻糖和甘露醇的加入抑制了蛋白氧化和变性，降低蛋白聚集程度，Kong Baohua等[15]也证实了这一点。冷冻保护剂与蛋白质分子结合后，使得肌原纤维蛋白凝胶网络结构中的自由水被捕获，有效阻止蛋白冷冻变性[27]。因此海藻糖和甘露醇可以提高虾蛄蛋白的成胶能力，这与动态流变结果一致。

凝胶持水力指凝胶保持自身水分或补充水分的能力，与凝胶内部结构的粗糙程度有关。虾蛄肌原纤维蛋白凝胶持水力的变化趋势与凝胶强度一致。肌球蛋白组分对凝胶的形成起关键作用[28]。样品中肌球蛋白参与凝胶的程度随着虾蛄冻融次数的增加而降低，因此持水力也随之下降。海藻糖和甘露醇的添加有利于凝胶持水力的提升，相较于对照组分别提高了7.1%（1 次冻融）、18.7%（3 次冻融）、29.0%（5 次冻融）。海藻糖和甘露醇等冷冻保护剂一方面可以通过氢键作用结合自由水，固定肉糜中的水分；另一方面也可以减少水分子在网络结构中的位移，从而提高持水力[27]。

2.2.3 凝胶微观结构

图7 冻融循环对肌原纤维蛋白凝胶微观结构的影响Fig. 7 Effects of freeze-thaw cycles on microstructure of myofibrillar protein gels

通过分析动态流变、凝胶强度与持水力结果，本实验选取未经冻融和经3、5 次冻融处理的蛋白进行凝胶微观结构表征。如图7所示，对照组和实验组的未冻融蛋白的热制凝胶结构致密，表面较为平整，孔隙分布均匀。经3、5 次冻融处理后（放大扫描电子显微镜观察倍数），蛋白凝胶结构劣变且程度逐渐加深，产生大量不规则的聚集体，三维网状结构不明显，说明肌原纤维蛋白在反复冻融过程中发生聚集，这与动态流变、凝胶强度与持水力的结果一致。添加海藻糖和甘露醇显著改善了蛋白的凝胶结构，表现为促使不规则的聚集体参与凝胶而形成多孔且孔径均一有序的三维网络结构，对应提高的凝胶强度及持水力。

2.3 冻融处理对虾蛄肌原纤维蛋白乳化特性的影响

图8 冻融循环对肌原纤维蛋白乳化活性（A）和乳化稳定性（B）的影响Fig. 8 Effects of freeze-thaw cycles on emulsifying properties of myofibrillar protein

如图8所示，随着冻融次数的增加，肌原纤维蛋白的乳化活性和乳化稳定性都显著下降（P＜0.05），其中冻融处理5 次后乳化活性和乳化稳定性下降了31.6%，这与Xia Xiufang等[29]在猪肉中的研究结果一致。此结果表明，反复冻融破坏了肌原纤维蛋白结构的完整性，导致蛋白与脂肪交联的能力下降，从而使其乳化活性及乳化稳定性下降。添加海藻糖和甘露醇后，蛋白的乳化活性和乳化稳定性均有不同程度回升。蛋白的乳化性受众多因素影响，其中蛋白变性是导致乳化能力下降的主要原因，氧化变性会限制蛋白在油滴表面吸附的灵活性[27]。此外，Srikar等[30]研究表明脂肪和游离脂肪酸的氧化产物也会降低蛋白的溶解性和乳化能力。结合研究结果和相关文献[15]，冷冻保护剂能显著抑制蛋白羰基化和脂质氧化，防止蛋白变性，从而起到稳定乳状液的作用。

糖醇类物质的抗冻作用机理是分子中的羟基与蛋白质分子的某些功能基团结合，使蛋白质分子处于饱和状态，从而避免蛋白质分子之间的聚集变性。同时，糖醇类物质的游离羟基还能有效地束缚水分子，从而降低“共晶点”温度，减少冰晶体的形成量，形成一个不完全冻结区域，隔离和减缓蛋白质分子的聚集，进而防止蛋白质的凝聚变性。一般，糖醇类物质的添加量与防止蛋白质冷冻变性的效果呈正比[31]。

3 结 论

本实验研究海藻糖和甘露醇对反复冻融引起的虾蛄肌原纤维蛋白结构和功能特性变化的影响。结果显示经过反复冻融处理，肌肉结构完整性破坏，蛋白氧化变性，表现为蛋白质羰基含量和表面疏水性增加，总巯基含量和色氨酸荧光强度显著下降，同时蛋白的功能性质（凝胶和乳化特性）下降，影响其食用及加工利用品质。而海藻糖和甘露醇的添加能有效抑制蛋白的变性程度，减少蛋白结构的变化，显著提高蛋白在热凝胶过程中的G’，改善蛋白的凝胶特性（凝胶强度、持水力和三维网络结构）、乳化活性和乳化稳定性。海藻糖和甘露醇作为食品添加剂添加到低温肉制品中，可改善肉品的胶着性、持水性和柔嫩性，减少营养损失，提高产品质量，具有广阔的应用前景。