基于有机酸HPLC 指纹图谱的甜樱桃果汁掺假鉴定

李佳秀，张春岭，刘 慧，陈大磊，刘杰超，焦中高*

（中国农业科学院郑州果树研究所，河南 郑州 450009）

甜樱桃（Prunus avium L.），也称大樱桃，为蔷薇科李属植物，其成熟果实色泽艳丽，富含多酚类物质、类胡萝卜素、褪黑素等生物活性成分，具有抗氧化、抗过敏、保护神经细胞、促进睡眠等功效，可预防癌症、心脑血管疾病、糖尿病、神经系统退行性疾病等多种慢性疾病的发生[1]，深受消费者喜爱。但由于甜樱桃果实肉软多汁，不耐贮运，严重影响了甜樱桃的市场供应和产业发展[2-3]。将甜樱桃加工成果汁、果酒、果酱等产品，不仅可满足人们美好生活和健康饮食的需要，而且延伸了甜樱桃产业链条，有助于减少甜樱桃采后损失，保障甜樱桃产业健康发展。其中，甜樱桃果汁较好保持了果实的色泽、香味和多酚类物质含量及抗氧化活性[4-5]，因此具有较好的市场前景。然而，由于甜樱桃原料价格较高，供应受限，使得甜樱桃果汁极易成为掺假的对象，因此迫切需要建立准确度高、适用性广的甜樱桃果汁掺假鉴定方法，以维护消费者利益和身体健康以及甜樱桃果汁行业正常生产秩序，保障甜樱桃果汁行业健康发展。

当前用于果汁掺假鉴定的方法主要有感官分析法、特征性成分分析法、光谱法、色谱法，以及分子生物学方法等[6-8]。Tezcan等[9]通过比较石榴汁与苹果汁的氨基酸组成发现L-天冬酰胺可以作为鉴别石榴汁中掺假苹果汁的特征成分；Nuncio-Jáuregui等[10]通过测定样品中的脯氨酸、酒石酸、蔗糖含量以及挥发性成分鉴定石榴汁中掺假葡萄汁或桃汁；Wang等[11]采用液相色谱-质谱技术结合主成分分析法，实现了纯柠檬汁与掺假柠檬汁（掺入柠檬酸、蔗糖及水）的非靶向识别；Zhang Jiukai等[12]采用液相色谱-四级杆飞行时间质谱技术结合代谢组学分析成功鉴别出蓝莓汁和蔓越莓汁中掺假苹果汁和葡萄汁的行为；Vardin等[13]利用傅里叶转换红外光谱结合化学计量学方法对浓缩石榴汁中掺假浓缩葡萄汁的行为进行鉴别；利用紫外光谱结合主成分分析可以清晰地识别苹果汁中掺假梨汁和甘蔗汁的行为[14]；单核苷酸多态性实时荧光定量聚合酶链式反应技术可用于橙汁中掺假柑橘汁的鉴别[15]。这些方法多基于一些特定的掺假行为或产品，识别方式单一，应用范围有限，难以适应愈来愈复杂隐蔽的掺假行为。因此，建立简单易行、适用性广泛、结果可靠的非靶向果汁鉴伪方法显得尤为迫切。

指纹图谱技术是一种从整体上研究复杂物质体系的非靶向化学分析方法，具有整体性和模糊性的特点，能够较全面地反映复杂物质体系多种化合物及其内在作用关系并显示特定的化学模式，通过与模式识别技术相结合可有效地提取分析有用信息，因此指纹图谱技术是对食品等复杂物质体系的整体情况进行研究的一种有效手段。通过建立特征指纹图谱，可以实现对产品质量和真实性的全面评估。指纹图谱技术目前主要应用于中草药及其制剂的质量分析与控制[16]，但近年来随着技术的发展，指纹图谱在食品掺假鉴定中也得到了较多的研究和应用[17-19]。喻凤香等[20]采用气相色谱法建立了米糠油的脂肪酸指纹图谱，通过相似度分析可实现掺伪量16%以上的米糠油的定量判断；胡明华等[21]利用硫酸水解及柱前衍生化高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析得到可可粉多糖组分的指纹图谱，结合系统聚类分析可实现掺加15%及以上可可壳的可可粉的鉴别；Tian Honglei等[22]采用气相色谱-质谱方法建立了小白杏杏仁油的脂肪酸指纹图谱，并成功应用于掺假鉴定；孙亚娟等[23]采用顶空固相微萃取和气相色谱技术建立杏仁油挥发性成分指纹图谱，可用于菜籽油掺伪量15%以上杏仁油的鉴别；李宝丽等[24]采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术建立预包装纯葡萄汁的香气成分的气相色谱-质谱指纹图谱，结合化学计量学分析能准确将预包装混合果汁、葡萄汁饮料和纯葡萄汁鉴别区分；楚刚辉等[25]采用HPLC指纹图谱结合主成分分析和聚类分析对喀什树莓果汁与市售其他果汁进行区分。但应用指纹图谱技术鉴别果汁的掺假还很少见。前期研究发现，不同种类果汁的有机酸组成存在较大差异，可以根据果汁中主要有机酸的组成特征来鉴别果汁类型和控制果汁质量[26]。在此基础上，本研究采用HPLC法对不同品种的42 个甜樱桃果汁的有机酸组成进行分析，构建甜樱桃果汁有机酸的HPLC指纹图谱，并通过相似度评价、主成分分析和聚类分析，对模拟在甜樱桃果汁中添加低价果汁（梨汁、苹果汁、杏汁和桃汁）和外源柠檬酸等掺假方式进行鉴别，以期为甜樱桃果汁的掺假鉴定和质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜樱桃果实采自河南新郑中国农业科学院郑州果树研究所大樱桃示范基地。采收后立即运抵实验室，剔除病虫害果、腐烂果，选取大小、着色基本一致的果实供制汁用。共选择14 个甜樱桃品种，每个品种在成熟期分3 次采样。供试甜樱桃品种及果汁样品编号见表1。

表1 供试甜樱桃果汁样品及编号Table 1 Samples and numbers of sweet cherry juice

草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、柠檬酸、富马酸标准品 美国Sigma公司；磷酸（分析纯） 天津市致远化学试剂有限公司；磷酸氢二铵（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1525型HPLC仪（配有2707自动进样器、2998二极管阵列检测器） 美国Waters公司；料理机 九阳股份有限公司；砂芯过滤装置 津腾实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果汁制备

按照以下工艺制备甜樱桃果汁：

甜樱桃果实→去核、梗→打浆→灭酶（沸水浴，5 min）→冷却→加果胶酶酶解（0.1%，50 ℃，40 min）→冷却→离心→过滤→甜樱桃果汁

制得的甜樱桃果汁贮存于－80 ℃超低温冰箱，分析前取出2 mL加水定容至10 mL，用0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.3.2 模拟掺假

掺加低价果汁：甜樱桃果汁中分别掺加体积分数为20%、40%、60%、80%、100%的梨汁、苹果汁、桃汁和杏汁作为伪品（表2）。

掺加外源酸：在原果汁含量为20%的樱桃汁中掺加柠檬酸作为伪品，柠檬酸掺加量为果汁总质量的0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，共5 个梯度（表2）。

表2 供试掺假样品及编号Table 2 Numbers of adulterate samples

1.3.3 色谱条件[26]

色谱柱：Ultimate®AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.02 mol/L (NH4)2HPO4溶液（磷酸调pH值为2.4）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；检测波长：210 nm。

1.3.4 方法学考察

1.3.4.1 精密度实验

取同一甜樱桃果汁样品，按1.3.3节色谱条件连续测定5 次，计算各共有峰保留时间和峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.4.2 稳定性实验

取同一甜樱桃果汁样品，按1.3.3节色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h测定，计算各共有峰的保留时间和峰面积的RSD。

1.3.4.3 重复性实验

取同一甜樱桃果汁样品，平行制备5 份供试样品溶液，按1.3.3节色谱条件分别进样测定，计算各共有峰保留时间和峰面积的RSD。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel处理实验数据，将HPLC图谱数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（V2.0）”软件，构建对照指纹图谱，并采用夹角余弦法进行相似度评价。用SAS9.3统计分析软件进行聚类分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 指纹图谱方法学考察结果

采用1.3.3节所述色谱条件，甜樱桃果汁样品连续测定5 次，各共有峰保留时间和峰面积的RSD分别小于0.15%和2.38%，说明该方法具有较高的精密度。同一样品在24 h内的6 次测定结果中，各共有峰保留时间和峰面积的RSD分别为0.05%～0.99%和0.37%～3.93%，说明该方法在24 h内稳定性良好。同时，重复性实验结果显示，各共有峰保留时间和峰面积的RSD分别为0.03%～0.14%和0.82%～2.82%，表明该方法具有较好的重复性。

2.2 指纹图谱共有模式的建立及相似度评价

2.2.1 指纹图谱共有模式的建立及共有峰的标定

所有甜樱桃果汁样品按1.3.3节色谱条件分别进样分析，得到不同甜樱桃果汁样品的HPLC图谱。将42 个甜樱桃果汁样品的HPLC图谱数据文件导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（V2.0）”，通过设置参照图谱、多点校正、色谱峰匹配、生成对照4 个步骤，得到42 个樱桃汁指纹图谱的共有模式（即对照指纹图谱），共标定了10 个共有峰，见图1。在1.3.3节色谱条件下，将草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、柠檬酸、富马酸及其混合标准品依次进样，根据保留时间将标准品溶液的色谱图与样品色谱图进行对比，共指认出了4 个共有峰，其中3号峰为苹果酸，4号峰为莽草酸，8号峰为柠檬酸，9号峰为富马酸。

图1 甜樱桃果汁HPLC指纹图谱Fig. 1 HPLC fi ngerprints of sweet cherry juices

2.2.2 共有峰的相对保留时间和相对峰面积

表3 42 个样品10 个共有峰的相对保留时间和相对峰面积Table 3 Relative retention times and relative peak areas of 10 peaks common to 42 samples

续表3

参照峰的确定是建立指纹图谱的关键，通常选取分离度较好、峰位居中、峰面积较大且稳定的色谱峰为参照峰[24,27]。通过比较42 个甜樱桃果汁的色谱图，发现3号峰（苹果酸）分离度好、比较稳定，峰面积也较大，因此选取3号峰作为参照峰，其保留时间和峰面积计为“1”，计算其余共有峰的相对保留时间的平均值和相对峰面积值，结果见表3。可以看出，42 个甜樱桃果汁样品的共有峰的相对峰面积差别较大，10 个共有峰的RSD在18.99%～64.97%之间，这说明42 个甜樱桃果汁的主要特征成分含量差别较大，不同品种、不同时间采摘的樱桃果汁的指纹图谱存在一定的差异。

2.2.3 相似度评价与阈值的确定

运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（V2.0）”对42 个樱桃汁样品色谱图和对照指纹图谱R进行相似度评价，结果见表4。可以看出，所有甜樱桃果汁的相似度都很高，42 个样品的指纹图谱与对照图谱之间的相似度均在0.948以上。不同品种、不同采摘时间的甜樱桃，其果汁有机酸HPLC指纹图谱的相似度差异并不明显。说明本研究建立的樱桃汁对照指纹图谱和标定的10 个共有峰可以反映甜樱桃果汁的有机酸指纹特征，具有鉴定评价意义。

在指纹图谱应用于真伪鉴定的评价中，通常采用不同样品与对照指纹图谱相似度的平均值或最小值作为阈值[28-29]。在本研究中，42 个不同甜樱桃果汁样品与对照指纹图谱的相似度均在0.948以上，因此可初步确定0.948为甜樱桃果汁的相似度阈值，相似度低于0.948则可能是掺假甜樱桃果汁。

表4 42 个甜樱桃果汁样品与对照指纹图谱的相似度Table 4 Similarity between fi ngerprints of sweet cherry samples and reference fi ngerprint

2.3 掺假样品的鉴别

甜樱桃果汁按1.3.2节掺假方法处理后，按1.3.3节色谱条件进样分析，得到25 种掺假样品的色谱图。应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（V2.0）”软件将掺假试样的指纹图谱与甜樱桃果汁对照指纹图谱进行相似度分析，结果见表5。

表5 掺假样品与甜樱桃果汁对照指纹图谱的相似度Table 5 Similarity between fi ngerprints of adulterate samples and reference fi ngerprint

由表5可以看出，随着低价果汁和柠檬酸掺加量的增加，掺假样品的指纹图谱与甜樱桃果汁对照指纹图谱的相似度降低。当梨汁与苹果汁的掺加量达到60%，杏汁的掺加量达到40%时，掺假样品与对照指纹图谱的相似度低于甜樱桃果汁的相似度阈值0.948，此时掺假样品与甜樱桃果汁可以区分开。当桃汁掺加量为100%，即完全由桃汁代替甜樱桃果汁时，才能鉴别出伪品。说明通过相似度评价，用甜樱桃果汁的HPLC指纹图谱鉴别掺有桃汁的甜樱桃果汁伪品的效果较差。由表5还可以看出，当柠檬酸的掺加量不小于0.1%时，掺假果汁样品与对照指纹图谱的相似度即低于甜樱桃果汁的相似度阈值0.948，从而可以鉴别出来。

2.4 主成分分析

以42 个樱桃样品和25 种伪品为研究对象，以每个样品的指纹图谱中各色谱峰面积组成原始数据矩阵，用SAS9.3统计分析软件进行主成分分析，结果见表6和图2。

表6 主成分的特征值及其贡献率Table 6 Eigenvalues, proportions and cumulative proportions of principal components

图2 主成分分析的得分图Fig. 2 Score plots obtained from PCA

由表6可以看出，根据特征值大于1提取主成分，共提取了3 个主成分，3 个主成分的累计方差贡献率为73.72%，基本可以反映大部分色谱峰数据所具有的信息。由图2可见，所有甜樱桃果汁的得分比较接近，在主成分分析得分图中聚在一起，添加柠檬酸的所有5 个伪品均远离甜樱桃果汁，说明通过主成分分析可以准确地识别掺假柠檬酸的甜樱桃果汁。掺假梨汁、苹果汁、杏汁、桃汁的伪品随着掺加量的增加，在得分图中的分布也越来越远，从而实现区分和鉴别。其中，在主成分1和主成分2的得分图中，掺假杏汁、桃汁的5个伪品均远离甜樱桃果汁，表明通过主成分1和主成分2的得分分析可以实现甜樱桃果汁中掺假杏汁和桃汁的鉴别；而掺加20%梨汁和20%苹果汁的伪品得分接近甜樱桃果汁，区分效果不佳。但在主成分1和主成分3的得分图中，掺假梨汁和苹果汁的所有伪品都可明显区分开来，说明通过主成分1和主成分3的得分分析可以实现甜樱桃果汁中掺假苹果汁和梨汁的鉴别。二者结合可以实现甜樱桃果汁与所有掺假样品的区分。

2.5 聚类分析

图3 甜樱桃果汁及掺假样品的聚类分析树状图Fig. 3 CA dendrograms of sweet cherry juices and adulterate samples

对42 个甜樱桃果汁样品和25 种掺假样品的原始色谱图提取色谱峰数据，获得一个矩阵，运用SAS9.3统计分析软件进行聚类分析，结果见图3。可以看出，当欧氏距离为0.55时，所有果汁样品聚为5 类，此时42 个甜樱桃果汁样品可以与25 种掺假样品全部区分开。其中，全部甜樱桃果汁样品和掺假柠檬酸的5 种伪品分别单独聚为一类，掺假杏汁和桃汁的10 种伪品聚为一类，掺加20%苹果汁的伪品（PW1）单独为一类，其余9 种伪品聚为一类。

3 讨 论

有机酸在果汁中的组成与含量主要与所用水果原料有关，因此可利用其有机酸组成特征来鉴别果汁种类[26]。Navarro-Pascual-Ahuir等[30-31]采用毛细管电泳法分析了不同来源的苹果汁、菠萝汁、橙汁、柑橘汁、葡萄汁产品中的有机酸组成及含量，发现苹果酸是苹果汁中最主要的有机酸，酒石酸是葡萄汁的特征性有机酸，异柠檬酸在橙汁、柑橘汁和菠萝汁中普遍存在，利用线性辨别分析方法对所得数据进行化学模式识别，可以实现全部5 种果汁及菠萝汁掺假50%葡萄汁和橙汁掺假50%葡萄汁的区分和鉴别。研究也表明利用不同种类果汁中有机酸的组成与含量结合化学计量学分析可对果汁种类进行一定的区分[26]。但由于受检测方法所限，这些研究所涉及的有机酸种类都比较少，所能提供的信息有限。本研究利用果汁中有机酸分析的HPLC法，建立了不同品种的42 个甜樱桃果汁的有机酸HPLC指纹图谱，共标定10 个共有峰，数据量较原有的分析结果（4 种有机酸）[26]大幅增加，为进一步进行化学计量学分析提供了更多的信息，有助于获得更准确的结果。同时，所有甜樱桃果汁样品与对照指纹图谱的相似度均在0.948以上，说明不同品种、不同采摘时间的甜樱桃所制得的果汁具有很好的一致性，所建指纹图谱较好反映了甜樱桃果汁的有机酸组成指纹特征，对于鉴别甜樱桃果汁具有参考意义。

将指纹图谱应用于食品质量评价与掺假鉴定必须借助一定的数据统计分析方法才可实现。目前常用的主要有相似度评价、主成分分析、聚类分析、线性辨别分析、偏最小二乘判别分析、多元线性回归等[19]。刘兴勇等[32]采用主成分分析、线性辨别分析和相似度评价3 种方法对玛咖及其制品HPLC指纹图谱进行模式识别，发现3种方法均能使玛咖与玛咖制品得到较为一致的模式识别结果，通过主成分得分平面图和辨别分析能够区分玛咖和玛咖制品。Lü Shidong等[33]采用相似度评价、主成分分析和聚类分析3 种方法对12 个云南普洱茶样品与龙井、竹叶青、六安瓜片、恩施绿茶、碧螺春6 个其他茶样品的气相色谱-质谱指纹图谱进行模式识别，均可得到满意的区分效果。本研究在模拟掺假甜樱桃果汁的鉴别中，分别采用相似度评价、主成分分析和聚类分析3 种方法对甜樱桃果汁样品和掺假样品的HPLC指纹图谱进行模式识别，发现主成分分析和聚类分析均可实现甜樱桃果汁与掺假样品的区分，而相似度评价的区分效果较差，仅能识别掺假量较高的样品。这一方面可能由于本研究掺假的样品与甜樱桃果汁成分比较接近，而本研究所采用的相似度评价方法不能有效识别甜樱桃果汁与掺假样品指纹图谱之间的细微差别。另一方面，由于本研究采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（V2.0）”中固定的算法（夹角余弦法）进行相似度评价，而相似度的算法不同，也可对区分效果产生影响[28]，因此在进一步的研究中，也可尝试不同的相似度计算方法来改善相似度评价法在甜樱桃果汁掺假鉴别中的应用效果。

此外，为保证果汁的真实性，本研究采用自制甜樱桃果汁，主要以不同品种和采收时间的甜樱桃果汁为基础建立了对照指纹图谱，初步证实了有机酸HPLC指纹图谱在甜樱桃果汁掺假鉴别中的可行性。但果汁中有机酸组成可能还会受到产地、年份以及加工工艺的影响，进一步加大取样范围有助于建立更准确、更有效的甜樱桃果汁指纹图谱鉴伪方法，从而促进指纹图谱技术在甜樱桃果汁鉴伪中的应用。

4 结 论

本研究根据甜樱桃果汁有机酸的HPLC分析方法，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（V2.0）”软件，建立了甜樱桃果汁HPLC指纹图谱。相似度评价结果表明，42 个甜樱桃果汁的有机酸指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均在0.948以上，不同品种、不同采收时间的甜樱桃果汁的指纹图谱具有很好的一致性。甜樱桃果汁中添加其他果汁或柠檬酸可导致相似度降低，而且掺假量越大，其指纹图谱与对照指纹图谱之间的差异越大，但掺假量较小的样品仅用相似度评价不能从甜樱桃果汁中分辨出来。应用甜樱桃果汁有机酸的HPLC指纹图谱结合主成分分析和聚类分析等模式识别方法，可以实现对甜樱桃果汁和所有掺假低价果汁（梨汁、苹果汁、杏汁和桃汁）和外源柠檬酸样品的区分，而且掺假量越大，区分效果越好。因此，有机酸HPLC指纹图谱结合化学计量学分析，可用于甜樱桃果汁掺假鉴定和质量控制。