甘蓝型油菜SNARE蛋白SYP122叶片瞬时表达体系的建立

许 静, 单亚楠, 何 豆, 陈淞渝， 庄 炜, 王爱荣

(福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002)

油菜是我国继水稻、玉米、小麦、大豆之后的第五大作物[1]，种植面积超过750万hm2[2]，其不仅是重要的油料作物，还是潜在的生物能源原料[3].油菜主要有3个栽培种，即甘蓝型油菜(Brassicanapus)、芥菜型油菜(B.juncea)和白菜型油菜(B.rapa)[4]，其中以甘蓝型油菜的种植范围最广[5].

随着基因工程技术的迅猛发展，转基因技术成为油菜基因功能研究的重要方法.目前常用的遗传转化方法有根癌农杆菌介导法、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)法、基因枪法、真空渗透遗传转化法和花粉介导法等[6-7].这些方法都不可避免地要经过脱分化及再分化过程，不仅耗时长、影响因素众多，而且对操作者的技术能力及试验条件都有较高的要求.农杆菌介导的基因瞬时表达系统可在短时间内大量表达外源基因，不需要经过世代培养，这使其成为基因功能研究的利器[8].近年来，学者们虽然针对油菜建立了农杆菌介导的瞬时表达系统，但是仅局限于子叶[6]和原生质体[9].为了高效地开展油菜基因功能的研究，在油菜叶片中建立一个成熟的基因表达体系显得尤为重要.

植物SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors)蛋白是参与细胞膜融合的一类重要蛋白，其家族成员在多种生物学过程中发挥重要作用，包括生长动态平衡、激素调节、胁迫反应和免疫反应[10-12].这类蛋白中，研究最深入的是PEN1(SYP121)，它对植物抗白粉病起着关键作用[10].拟南芥(Arabidopsisthaliana)AtSYP121及其同源蛋白AtSYP122在植物的防御信号途径中起着负调控作用，是细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)以及水杨酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)和乙烯(ethylene, ET)信号通路的负调控因子[13].然而，AtSYP122对植物抗白粉病的作用很小[14-15].在细胞膜分泌或锚定在细胞膜的蛋白中，二者的货物蛋白群体也存在较大差别[16-17].本实验室前期研究发现，油菜SYP122同源蛋白在抗死体营养型病原菌——核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)方面发挥重要功能.

本研究拟克隆甘蓝型油菜中双九号的BnSYP122基因，并将其构建到带有黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)的植物表达载体pEarleyGate 104上，通过农杆菌介导的真空渗透法在4周龄油菜的叶片中表达YFP-BnSYP122及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)，通过荧光观察和Western blot 检测分析其表达效果，初步验证油菜BnSYP122的亚细胞定位，以期为进一步阐明BnSYP122在油菜抗菌核病中的功能提供一定的依据，并为油菜基因功能研究提供一定的技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料

供试植物为甘蓝型油菜中双九号，种子播于含黑土和蛭石(1∶1)的营养土中，置于23 ℃的温室中，光暗比为16 h∶8 h，光照度为5 500 lx，覆盖保鲜膜培养3～4 d.待幼苗子叶展开，去掉保鲜膜，一周后将油菜苗移栽至新的花盆中，每3～5 d浇水一次，10 d浇营养液一次，继续培养3～4周，至油菜长出4～5片真叶，即可用于瞬时表达.

瞬时表达所用的对照载体pEGAD-GFP、构建重组载体所用Gateway方法克隆入门载体pDONR/Zeo、植物表达载体pEarleyGate 104(35S-YFP-Gateway-OCS3′)为本实验室留存.试验所用的真空泵为AF2000真空抽滤器(购自宁波奉化晨光威腾自动化机械有限公司).

1.2 方法

1.2.1BnSYP122基因的鉴定及序列分析 在拟南芥数据库(https://www.arabidopsis.org/)中搜索AtSYP122，得到其编码基因及蛋白的氨基酸序列，将该序列作为模板在油菜数据库(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中BLAST之后，获得与AtSYP122最同源的序列，根据该序列的开放阅读框(open reading frame， ORF)设计引物.采用油菜中抗品种中双九号[18]的cDNA作为模板进行PCR扩增，将获得的片段构建于pMD18-T载体上，送上海生工生物科技有限公司测序.将获得的序列翻译后与拟南芥AtSYP122进行比对分析.

将扩增获得的AtSYP122在油菜中的同源基因序列翻译成氨基酸序列后，在SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)中分析其保守功能域；用在线软件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=%2FNPSA%2Fnpsa_seccons.html)预测分析其二级结构；同时，在http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/中进行跨膜结构域的预测.

1.2.2 表达载体的构建 根据Gateway试剂盒说明书设计引物，两端加上接头attB，以油菜cDNA为模板扩增获得油菜BnSYP122基因全长.按照Gateway试剂盒说明书将扩增到的PCR产物通过BP反应连接到pDONR/Zeo载体，并转化DH5α感受态，涂布于含Zeocin的LB培养基，37 ℃倒置培养，20 h后挑选单克隆进行PCR验证.将验证正确的转化子送上海生工生物科技有限公司测序.选择序列正确的单克隆，提取质粒进行LR反应，同样转化DH5α感受态并筛选转化子，将验证正确的转化子进一步采用冻融法转化农杆菌GV3101菌株.

1.2.3 真空渗透法表达目的蛋白 挑取农杆菌单克隆置于含有5 mL LB液体培养基和终浓度为50 ng·mL-1卡那霉素的试管中，28 ℃、200 r·min-1振荡培养36 h后，以1∶1 000的比例转接至含有150 mL LB液体培养基和终浓度为50 ng·mL-1卡那霉素的锥形瓶中，继续培养至D600 nm为0.6～0.8，离心并收集菌体.然后用渗透缓冲液(10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，150 μmol·L-1乙酰丁香酮，0.02% Silwet L-77)重悬，离心并重悬3次后，调节D600 nm为0.6，28 ℃静置2～3 h.

将农杆菌悬浮液置于广口瓶或培养盒中与油菜并排放置在AF2000真空抽滤器中，油菜的叶片向下浸入到农杆菌悬浮液中，打开真空泵，设置压力最大值为0.06 MPa，保持真空状态15～20 min.取出油菜植株并用吸水纸将叶片表面水分沾干，可观察到50%油菜叶片出现水渍斑，黑暗条件下放置12 h后，移到光照条件下正常培养2～3 d.

1.2.4 激光共聚焦显微镜观察目的蛋白的表达情况 用刀片切取3 mm×3 mm大小的侵染过农杆菌的油菜叶片，下表皮朝上置于载玻片，盖上盖玻片并在盖玻片与载玻片之间滴一滴无菌水，置于激光共聚焦显微镜下，在488 nm激光下观察.

1.2.5 Western blot验证目的蛋白的表达情况 取200 mg油菜叶片于液氮中充分研磨，转移到2 mL EP管中并加入100 μL蛋白提取缓冲液[50 mmol·L-1Tris (pH 7.5),150 mmol·L-1NaCl,0.5% Triton X-100,0.5% Nonidet P-40,0.25% Na-deoxycholate, 1×蛋白酶抑制剂]，充分涡旋混匀.12 000 r·min-1离心15 min，吸取上清液，等体积加入2×SDS蛋白上样缓冲液，煮沸10 min变性.

取20 μL蛋白样品跑SDS-PAGE胶，进行Western blot检测，转膜后按照1∶5 000的比例加入GFP羊抗鼠一抗进行杂交，随后以1∶8 000的比例加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的二抗，将杂交后的膜加入western BrightTMECL显影剂后在化学发光成像仪tanon-5200下观察.

2 结果与分析

2.1 油菜BnSYP122蛋白的鉴定

以拟南芥AtSYP122的氨基酸序列为种子序列在已公布的油菜蛋白数据库中进行BLAST搜索，结果比对到与其同源性最高的蛋白序列BnaA04g05470D.根据此蛋白的基因序列设计引物，以油菜中双九号的cDNA为模板进行片段扩增并测序，经翻译后将其蛋白序列BnSYP122_ZS9与数据库中的BnaA04g05470D、AtSYP122进行多重序列比对分析.结果发现，扩增基因的蛋白序列与BnaA04g05470D存在4个氨基酸的差别(图1).但是，这2个蛋白序列与AtSYP122的同源性高达80.4%，并且都具有保守的SNARE 结构域(SNARE-domain)(图1).这表明鉴定和扩增获得的蛋白是典型的SNARE蛋白，可能与AtSYP122具有类似的功能，并将扩增获得的蛋白序列命名为BnSYP122.

黑色填充部分表示氨基酸序列完全相同；蓝色填充部分表示氨基酸序列有2个相同；黑色横线区域为t-SNARE保守基序；红色箭头指示BnSYP122_ZS9与BnA04g05470D的差异氨基酸.图1 BnSYP122和AtSYP122的序列比对Fig.1 Sequence alignment of BnSYP122 and AtSYP122

2.2 BnSYP122蛋白结构预测与分析

SMART预测表明，BnSYP122 N端的39～165位氨基酸为SynN结构域(图2A、2B)；通过SOPMA对其二级结构进行预测发现，在蛋白的N端依次排列着Ha﹑Hb和Hc 3个α-螺旋束(图2D).这表明BnSYP122是SNARE蛋白家族的突触融合(syntaxin)蛋白.在其C端的286～305位存在一个跨膜结构域(图2A、2B)，表明BnSYP122可能为跨膜蛋白，定位于细胞膜.为了确认其可靠性，使用TMHMM 2.0再次预测了BnSYP122的跨膜结构域(图2C)，该结果与SMART的预测结果一致.

A.SMART预测的结构域示意图；B.SMART预测的结构域列表；C.TMHMM 2.0预测的跨膜结构示意图；D.SOPMA预测的N端二级结构示意图.图2 BnSYP122的结构域分析Fig.2 Structure analysis of BnSYP122

2.3 表达载体的构建与农杆菌转化

以油菜中双九号的cDNA为模板进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，检测到约1 000 bp的目的条带(图3A)，切胶回收后进行Gateway入门反应，并转化大肠杆菌DH5α感受态.将Zeocin筛选的单克隆，以pDONR载体引物M13-F搭配片段引物BnSYP122-R进行PCR验证，得到略大于1 000 bp的条带(图3B).测序正确后提取质粒与载体pEarleyGate 104进行LR反应，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑选经卡那霉素筛选后的单克隆进行菌落PCR验证，4个单克隆均扩增到约1 000 bp的条带(图3C).提取质粒采用冻融法转化农杆菌GV3101，卡那霉素和利福平筛选到的单克隆经PCR验证为阳性克隆(图3D).以上结果表明， pEarleyGate 104-BnSYP122重组载体构建成功，并转化获得农杆菌菌株，可用于下一步的油菜侵染试验.

2.4 油菜叶片目的蛋白的荧光分析

为了验证GFP和目的蛋白BnSYP122是否在油菜叶片中正常表达，使用激光共聚焦显微镜分别观察用真空渗透法表达GFP和YFP-BnSYP122的油菜叶片.如图4B所示，在处理的叶片细胞中可以观察到均匀分布的绿色荧光，表明外源基因可以在油菜叶片中正常翻译成蛋白.将BnSYP122蛋白融合YFP标签进行定位观察，结果显示，与位于细胞膜、细胞质及细胞核的GFP相比，BnSYP122明显定位于细胞膜(图4C)，与生物信息学预测结果一致.以上结果说明真空渗透法不仅能够在油菜叶片中成功表达目的蛋白，还能够准确显示目的蛋白的亚细胞定位.

2.5 Western blot验证目的蛋白的表达

为了进一步确定目的蛋白在油菜叶片中的正常表达，收集经含有GFP和YFP-BnSYP122表达载体的根癌农杆菌菌液真空渗透处理2 d的油菜叶片，提取总蛋白，用Western blot检测其蛋白表达量.结果显示，用GFP抗体杂交后获得与目的蛋白大小一致的条带(图5)，说明真空渗透法确实能够正常表达目的蛋白.

A.BnSYP122的扩增，其中M为Marker DL2000,1-4为扩增到的PCR片段；B.pDONR/Zeo-BnSYP122菌落PCR验证，其中M为Marker DL2000,1-4为大肠杆菌单克隆；C.pEarleyGate 104-BnSYP122菌落PCR验证，其中M为Marker DL2000,1-4为大肠杆菌单克隆；D.菌落PCR验证GV3101转化子，其中M为Marker DL2000,1-4为农杆菌单克隆.图3 BnSYP122的扩增及Gateway法构建重组载体的验证Fig.3 Amplification of BnSYP122 and verification of recombinant vector constructed by Gateway technique

A.未经处理的油菜叶片;B.真空渗透表达GFP的油菜叶片；C.真空渗透表达YFP-BnSYP122的油菜叶片.BF.明场;GFP.绿色激发光场景；Merge.融合明场和激发光场景.图4 激光共聚焦验证GFP及YFP-BnSYP122在油菜叶片中的瞬时表达Fig.4 Transient expression of GFP and YFP-BnSYP122 in B.napus leaves verified by confocal laser

A.Western blot检测到的蛋白条带；B.考马斯亮蓝染色的总蛋白.图5 Western blot验证GFP和YFP-BnSYP122在油菜叶片中的表达Fig.5 Expression of GFP and YFP-BnSYP122 in B.napus leaves verified by Western blot

3 讨论

农杆菌介导的瞬时表达体系建立方法主要包括注射法和真空侵染法，2种方法在烟草中均能取得较高的表达效率.有报道称，由于油菜叶片特殊结构及叶脉的影响，农杆菌注射法无法在油菜叶片中取得较好的表达效果，而在子叶中可以成功完成瞬时表达[6].作者初期采用注射法在油菜叶片中表达GFP蛋白，效果也不理想.成熟植株的叶片具有更容易操作、表达蛋白获得量大、有利于后期功能研究等优势，因此，本研究测试真空侵染法是否能在油菜叶片中表达报告基因GFP和YFP融合的SNARE蛋白BnSYP122.

采用烟草的真空侵染体系，参考油菜的稳定表达方法，渗透缓冲液在MMA(10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，150 μmol·L-1乙酰丁香酮)的基础上，加入了Silwet L-77辅助侵染[19].采用真空侵染法在烟草叶片中表达外源蛋白，当压力为0.06 MPa时，只需要1～3 min就可以完成[20-21]；而在油菜中双九号的叶片中，至少需要10 min.这说明农杆菌侵入油菜叶片比侵入烟草困难，因此，注射法无法取得较好的表达效果.真空侵染的最适时间与油菜苗龄和长势关系密切，4周龄的油菜叶片经真空侵染15～20 min可取得较好的效果，超过25 min可能导致叶片细胞坏死、萎蔫.农杆菌的菌液浓度与转化效率关系密切，浓度过高可能导致植物叶片萎蔫，过低则转化效率较低[6].本研究参考子叶瞬时表达设置农杆菌D600 nm为0.6～0.8，取得了较好的表达效果.通过农杆菌介导的真空侵染法将BnSYP122基因在油菜叶片中成功瞬时表达，并应用此方法成功表达了油菜的外源基因GFP.

据报道，SYP122定位于质膜[22]，其所在亚家族Qa-SNARE共同的结构特征为一个N端的3个螺旋束(Ha、Hb、Hc)、一个由60～70个氨基酸组成的SNARE保守基序、一个Linker和位于C端的跨膜结构域[11].这与本试验结果高度一致，说明本研究建立的农杆菌真空侵染法不仅能够快速、方便地表达目的蛋白，还能够精准地观察目的蛋白的亚细胞定位.