牛至香酚对LPS所致的免疫应激小鼠脾脏细胞因子及核转录因子mRNA表达的影响

吕明其, 闵思明, 衣伟萌, 陈杨超, 甘思言, 乔 石, 黄一帆, 马玉芳

[1.中西兽医结合与动物保健福建省高等学校重点实验室；2.福建省兽医中药与动物保健重点实验室(福建农林大学)，福建 福州 350002]

牛至(Origanumvulgare)又名止痢草，为唇形科(Lamiaceas)牛至属(Origanum)多年生草本植物或半灌木.牛至味辛、性凉、无毒，具有清热解表、理气化湿、利尿消肿之功效，曾收载于《中华人民共和国药典》(1977年版)[1].牛至香酚是从牛至中提取的一种特殊芳香气味的挥发性植物精油，主要成分包括百里香酚、香荆芹酚、γ-萜品烯、p-异丙甲苯等酚类化合物.研究表明，牛至香酚具有促生长[2]、增强免疫力[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]等功效.

本课题组前期研究表明，牛至香酚能促进断奶仔猪的生长性能，提高机体免疫功能[6-7].脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性菌膜结构物质，通过靶细胞上的Toll样受体的信号转导作用将单核、巨噬细胞浆内核转录因子κB激活，使机体中的炎性介质大量释放造成机体损伤.研究表明，LPS是能引发免疫造成机体损伤的主要物质，大鼠腹腔注射LPS能够造成脾脏组织急性损伤或严重感染[8].牛至香酚对免疫应激小鼠脾脏细胞因子mRNA表达的影响鲜见报道.本试验拟研究牛至香酚对免疫应激小鼠脾脏细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-1β)、NF-κB及核转录因子(T-bet、GATA-3)mRNA表达的影响，旨在从分子水平上探讨牛至香酚对免疫应激小鼠的免疫调节机理，丰富牛至香酚免疫药理学研究内容，为其进一步的开发应用提供数据借鉴.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 80只健康雄性清洁级KM小鼠体重(22±2) g，购自福建医科大学实验动物中心.

1.1.2 试剂 牛至香酚(百里香酚、香芹酚的含量为67%)由福建中农牧生物药业有限公司惠赠；注射用LPS购自Sigma公司；RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒购自大连TaKaRa公司.

1.1.3 仪器与设备 主要仪器与设备有独立送回风净化笼具(苏州市苏杭科技器材有限公司)、电子分析天平[梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司]、SW-CJ-1F型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)、ALLEGRA X-22R型冷冻离心机(美国贝克曼库尔特公司)、CFX96型实时荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)、SK-1快速混匀器(金坛市科析仪器有限公司).

1.2试验动物分组与处理

将80只小鼠适应性饲养1周后随机分成5组(空白对照组、模型组及牛至香酚低、中、高剂量组)，每组16只.所有小鼠均自由饮水、采食.牛至香酚低、中、高剂量组分别按25、50、100 mg·kg-1的剂量灌胃牛至香酚，空白对照组、模型组则灌胃相同体积的橄榄油，每日1次，连续14 d.第15天时牛至香酚试验组、模型组均按8 mg·kg-1的剂量腹腔注射LPS，空白对照组注射等量的生理盐水.

1.3 样品采集与处理

小鼠腹腔注射LPS 6 h后，采用颈椎脱臼法处死.无菌取脾脏组织，装入经DEPC水处理后的Eppendorf管，置-80 ℃冻存.

1.4 小鼠脾脏细胞因子、核转录因子mRNA表达水平的测定

采用qRT-PCR检测小鼠脾脏细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α)、NF-κB及核转录因子(T-bet、GATA-3) mRNA的表达水平.

1.4.1 RNA的提取 将脾脏组织放入1.5 mL去酶管中，于冰上研磨，加入1 mL RNAiso Plus混匀，用离心管分装两管，室温静置5 min；每个离心管加入200 μL氯仿，振荡至液体乳化呈乳白色，室温静置3 min，于4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min；上清液转移至新的离心管中，并加入等体积的异丙醇，室温静置10 min；于4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min，弃RNA沉淀，于4 ℃、7 500 r·min-1离心5 min，弃上清液.室温下放置干燥，加入20 μL RNase-free水使RNA溶解，测定RNA的浓度和纯度[9].

1.4.2 cDNA的合成 反转录体系为：2 μL 5×Prime ScriptTM缓冲液、0.5 μL Prime ScriptTMRT Enzyme MixⅠ、0.5 μL 50 μmol·L-1Oligo dT Primer、0.5 μL 10 μmol·L-1Random 6mers、1 μL总RNA、5.5 μL无DNA酶水.反转录程序：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃保存.

按照反转录试剂盒说明书的步骤将提取的RNA反转录成cDNA，按照SYBR Premix EX TaqTM试剂盒说明书的步骤测定细胞因子mRNA的表达量.

表1 引物序列及扩增长度Table 1 Primer sequences and product sizes

1.4.3 qRT-PCR检测 qRT-PCR反应体系：0.25 μL正向引物、0.25 μL反向引物、6.25 μL SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、1 μL cDNA、4.75 μL dH2O.扩增条件：95 ℃预变性120 s；95 ℃变性5 s，退火至62 ℃，延伸30 s，38个循环；65 ℃延伸5 s.经过相应条件扩增后，以β-actin为内参基因，每个样本进行3次重复.引物序列及扩增长度[9-10]如表1所示，由上海生物工程有限公司合成.

1.5 数据处理

将每个DNA样品分别进行RT-PCR检测，检测结果采用相对定量法，测得样品的循环阈值(Ct)，采用2-△△Ct法计算并分析不同试验组相关引物的变化情况.△△Ct=[Ctm(待测样品)-Ctn(待测样品)]-[Ctm(对照样品)-Ctn(对照样品)]，式中，m表示目的基因，n表示内参基因.本试验以β-actinRNA作为内参基因，其余引物的RNA作为目的基因.试验数据采用SPSS 21.0统计软件进行单因素方差分析，并以“平均值±标准差”表示，采用LSD法进行多重比较，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著.

2 结果与分析

2.1 牛至香酚对LPS所致的免疫应激小鼠脾脏细胞因子mRNA表达水平的影响

牛至香酚对LPS所致的免疫应激小鼠脾脏细胞因子mRNA表达水平的影响见表2.由表2可知，与空白对照组相比，模型组小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、NF-κBmRNA的表达量极显著提高(P<0.01).与模型组相比，牛至香酚试验组致炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6 mRNA的表达量有所下降，且差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)；NF-κBmRNA的表达量降低，其中，牛至香酚高剂量组与模型组的差异显著(P<0.05).与空白对照组相比，模型组IL-10 mRNA的表达量显著提高(P<0.05)；与模型组相比，牛至香酚低、高剂量组IL-10 mRNA的表达量有所提高，中剂量组降低；牛至香酚试验组IL-10 mRNA表达量与空白对照组的差异极显著(P<0.01).

表2 牛至香酚对小鼠脾脏细胞因子mRNA表达水平的影响1)Table 2 Effect of oregano phenol on cytokine mRNA expression in the spleen of the experimental mice

1)同列数据后附不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)，附不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同字母者表示差异不显著(P>0.05).

2.2 牛至香酚对LPS所致的免疫应激小鼠脾脏核转录因子mRNA表达水平的影响

牛至香酚对LPS所致的免疫应激小鼠脾脏核转录因子mRNA表达水平的影响见表3.由表3可知：与空白对照组相比，模型组小鼠T-betmRNA的表达量极显著提高(P<0.01)，GATA-3 mRNA的表达量及T-bet/GATA-3比值极显著降低(P<0.01)；与模型组相比，牛至香酚试验组T-betmRNA的表达量下降，但差异不显著(P>0.05).牛至香酚中剂量组GATA-3 mRNA的表达量显著高于模型组(P<0.05)，低、高剂量组的表达量虽高于模型组，但差异不显著(P>0.05).与模型组相比，牛至香酚试验组的T-bet/GATA-3比值有所上升，但差异不显著(P>0.05).

表3 牛至香酚对小鼠脾脏核转录因子mRNA表达水平的影响1)Table 3 Effect of oregano phenol on the mRNA expression of transcription factors in the spleen of the experiment mice

1)同列数据后附不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)，附不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同字母者表示差异不显著(P>0.05).

3 讨论

LPS作为一种免疫刺激剂，能通过靶细胞上的Toll样受体的信号转导作用将单核、巨噬细胞浆内核转录因子κB激活，引起免疫应答，从而启动TNF-α，IL-1、IL-6等炎症细胞因子的转录与表达[11]，而抗炎因子IL-10在抑制巨噬细胞分泌致炎因子的同时还抑制Th1细胞产生免疫调节性细胞因子，在机体免疫抑制中起重要作用[12].NF-κB是一类具有多项调节功能的核转录因子，TNF-α通过与其受体结合来激活NF-κB，而IL-6的产生需要NF-κB在骨髓细胞中被激活.当组织中的IL-6含量增高时，NF-κB含量也会发生相应变化[13].脾脏是机体最大的外周免疫器官，含有大量的淋巴细胞、巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心.LPS可以促进相关炎性细胞因子分泌的增加诱发脓毒血症导致免疫细胞凋亡[14].

本试验中，牛至香酚试验组脾脏致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达量低于模型组，但IL-10 mRNA的表达量高于模型组，这与惠永岗等[15]的“葡萄糖—胰岛素—钾极化液(GIK)试验组IL-10水平高于LPS组，IL-1β、TNF-α水平低于LPS组”研究结果相似.本试验中，模型组NF-κBmRNA的表达量极显著高于空白对照组，牛至香酚高剂量组较模型组显著降低，此结果与韩琳等[16]的“黄芪多糖能通过抑制NF-κB缓解LPS造成的损伤”研究结果相似.表明牛至香酚能有效降低LPS引起的IL-1β、IL-6、TNF-α等致炎因子mRNA的表达量，提高IL-10抗炎因子mRNA的表达量，提示牛至香酚能有效减轻LPS引起的炎症，帮助机体恢复健康.

Th1、Th2细胞的分化平衡是机体免疫应答调节的重要环节，与疾病发生、发展和转归的关系密切.T-bet、GATA-3是调节Th细胞特异性分化的核转录因子，分别调控Th细胞向Th1、Th2细胞转化，影响细胞因子在体内的转换[17-18].Th1细胞分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子，主要参与细胞免疫应答；Th2细胞主要分泌IL-6、IL-10等细胞因子，主要参与机体的体液免疫[19].正常情况下，Th1、Th2细胞在机体内处于相对平衡的状态，当机体发生异常功能时，两者之间的动态平衡被打破[20].研究表明，系统性红斑狼疮(SLE)患者中GATA-3的表达量高于正常人，Th2细胞增多，引发Th1、Th2细胞分化失衡，造成自身免疫紊乱[21].研究表明：台湾紫芝多糖能显著提高Th1转录因子T-bet的表达，同时降低Th2转录因子GATA-3的表达[22]；不同浓度的金线莲多糖可显著降低免疫抑制小鼠脾脏组织中T-bet的表达或显著增强GATA-3的表达[23].研究还表明，强鸡散(主要由黄芪、党参、白头翁等组成)具有调节环磷酰胺致免疫抑制小鼠脾脏核转录因子GATA-3、T-bet表达量的作用，通过降低GATA-3的表达量，使Th1、Th2细胞的分化平衡向Thl方向转化[24].

本试验结果表明，LPS可不同程度地提高小鼠脾脏细胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α的表达，引发Th1、Th2细胞分化失衡.与模型组相比，牛至香酚试验组脾脏组织中GATA-3 mRNA的表达量增加，T-betmRNA的表达量减少；牛至香酚试验组的T-bet/GATA-3比值较模型组提高，提示牛至香酚通过提高T-betmRNA的表达量，降低GATA-3 mRNA的表达量来维持机体Th1、Th2细胞分化的动态平衡，减少Th0细胞向Th1或Th2细胞发生漂移，减少LPS造成的免疫应激.综上所述，牛至香酚可以调节LPS应激状态对应的脾脏相关细胞因子及核转录因子mRNA的表达；调节细胞因子mRNA的转录，促进相关细胞因子的分泌，从而维持Th1、Th2细胞分化的动态平衡，表明牛至香酚能对LPS造成的脾脏免疫损伤有很好的保护作用.这与李鹏等[25]的“由牛至油、肉桂油、百里香油组成的植物精油对于LPS所致的仔猪肝脏刺激有较好的保护作用”研究结果相似.

4 小结

本试验结果表明，牛至香酚能通过调节免疫应激小鼠脾脏核转录因子mRNA的表达，调节细胞因子mRNA的转录，促进相关细胞因子的分泌，减轻LPS对脾脏造成的免疫应激损伤.