N-乙酰半胱氨酸对慢性阻塞性肺疾病患者体内炎症水平的影响

武小杰，陈菁

(武汉市中西医结合医院呼吸内科，武汉 430022)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种高患病率、高致残率和高死亡率的慢性疾病，严重威胁人类健康[1]。氧化应激和炎症反应是COPD的主要发病机制，但二者的潜在关联有待进一步确认[2-3]。目前COPD的治疗主要集中在减轻气道的慢性炎症如抗氧化治疗，其通过清除体内活性氧自由基，增加总超氧化物歧化酶的活性，起到保护细胞的作用[4-5]，但抗氧化治疗是否减轻炎症反应，目前的研究并不十分清楚。国外有研究报道N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)能降低羊胚胎上皮细胞在香烟烟雾提取物刺激后白细胞介素(IL)-6的表达[6]。国内针对NAC在COPD治疗方面的研究较多，如对COPD急性加重、血气分析指标的影响等[7-8]。但笔者未见涉及COPD患者NAC治疗前后炎症指标的改变，特别是COPD患者人体细胞刺激后对NAC反应的研究。2016年3月—2017年4月，笔者观察了COPD患者在NAC治疗前后炎症因子和肺功能的变化，并收集COPD患者的单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)在体外研究NAC对其的影响，旨在探讨抗氧化治疗对COPD患者体内炎症因子及肺功能的影响，及在细胞水平进一步研究抗氧化治疗对外界因素刺激后的炎症反应的影响。

1 资料与方法

1.1临床资料 本研究采用临床随机对照试验，选取我院收治的COPD稳定期患者90例，通过随机数字表法将患者随机分为治疗组(46例)和对照组(44例)。病例纳入标准：所有患者均符合COPD的诊断标准[9]，稳定期研究对象为近3个月无COPD急性加重患者。排除标准：患有其他呼吸系统疾病，如哮喘、支气管扩张、间质性肺病及肺结核，有肺手术病史；患有血液系统疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、精神障碍、严重全身疾病者。本研究已通过我院伦理委员会批准，所有患者了解研究过程并签署知情同意书。

1.2治疗方法 对照组患者给予COPD基础治疗，包括吸入药物治疗，如吸入糖皮质激素、β2-受体激动药和(或)胆碱能受体阻断药等；治疗组患者在对照组基础上给予NAC泡腾片(浙江金华康恩贝生物制药有限公司，批准文号：国药准号H20057334，规格：每片600 mg)600 mg，po，bid，两组疗程均为半年。

1.3患者指标检测

1.3.1血清炎症因子测定 采集患者治疗前后晨起空腹外周静脉血5 mL，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中IL-6、IL-8水平。IL-6试剂盒(货号：JK-SJ-36472)、IL-8试剂盒(货号：JK-SJ-36468)，两种试剂盒均购于上海晶抗生物工程有限公司。

1.3.2肺功能评估 采用德国耶格Jaeger 肺功能仪，由专业人员操作，分别测定第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1%pred)及第1秒用力呼气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)即一秒率，每次测定3 次，取平均值。

1.4外周血的PBMC刺激实验

1.4.1PBMC分离及培养 取治疗组20例COPD患者外周血4 mL与无菌磷酸盐缓冲液(PBS，HyClone海克隆有限公司，货号：SH30256.01)4 mL按照1：1混合，充分混匀；将稀释后的血标本倾斜45°，贴壁、液面上方1 cm缓慢加至人血单个核细胞分离液(TBD，天津灏洋公司，货号：LTS1077)的分离液中，TBD分离液与稀释后的血标本比例1：1；25 ℃，1500 r·min-1(r=15 cm)离心20 min，离心后取云雾层置入15 mL离心管中，加入5倍以上的PBS洗涤，充分摇匀，4 ℃、2000 r·min-1(r=15 cm)条件下再次离心8 min，后弃上清液，洗涤两次，最后取沉淀物即PBMC。

1.4.2香烟烟雾提取物(cigaratte smoke extract,CSE)的制备 按XU 等[10]介绍的方法，将2 支去过滤嘴香烟于一个注射器驱动装置连续抽吸而燃，吸入的烟雾经三通另一个出口通入50 mL无血清培养液中制成悬液。悬液用1 mmol·L-1氢氧化钠(NaOH)调至pH值为7.4，经孔径0.22 μm微孔滤膜滤过备用。制备的CSE于-40 ℃环境下冻存，解冻后在30 min 之内用于实验。

1.4.3PBMC刺激实验方案及指标检测 将1×106·mL-1PBMC加入RPMI 1640培养液(美国Gibco 公司产品，货号：17005042)4 mL中，细胞实验分为3组，①CN组：无刺激剂；②CSE组：细胞中加入5% CSE；③CSE+NAC组：先用3 mmol·L-1NAC 预处理3 h，再用5%CSE刺激。以上操作完成后，继续培养24 h，收集细胞培养的上清液，ELISA法测定上清液中IL-6、IL-8。每个处理组设置3 个复孔。

2 结果

2.1患者入院基本情况 两组患者在年龄、性别、吸烟状况及肺功能水平方面均差异无统计学意义(P>0.05)，两组间数据具有可比性。见表1。

表1 两组患者基本情况比较Tab.1 Comparison of baseline data between two groups of patients

2.2两组治疗前后血清炎症因子水平 治疗组治疗后血清IL-6、IL-8水平较治疗前显著下降(P<0.05或P<0.01)。而对照组IL-6、IL-8水平较治疗前有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.3两组治疗前后肺功能指标比较 两组患者初始入组时的肺功能FEV1%pred数值差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。经治疗后，两组患者的肺功能(FEV1%pred)水平均有所升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.4PBMC在刺激物作用后炎症因子的影响 CSE刺激后IL-6的表达水平显著升高，与CN组比较差异有统计学意义(t=8.28，P<0.01)；而采用NAC预处理后，IL-6的表达水平明显降低，与CSE组比较差异有统计学意义(t=3.41，P<0.01)。CSE刺激后IL-8的表达水平显著升高，与CN组比较差异有统计学意义(t=14.50，P<0.01)；而采用NAC预处理后，IL-8的表达水平明显降低，与CSE组比较差异有统计学意义(t=5.33，P<0.01)。见图3。

与本组治疗前比较，*1 P<0.05，*2P<0.01。图1 两组患者治疗前后血清炎症因子比较Compared with the same group before treatment,*1P<0.05,*2P<0.01.Fig.1 Comparison of serum inflammatory cytokines between two groups of patients before and after treatment

图2 两组患者肺功能比较Fig.2 Comparison of lung function between two groups of patients

与CN组比较，*1P<0.01；与CSE+NAC组比较，*2P<0.01。图3 PBMC在刺激物作用前后炎症因子表达的比较compared with control group，*1P<0.01；compared with CSE+NAC group，*2P<0.01.Fig.3 Comparison of inflammatory cytokines in PBMC before and after stimulation

3 讨论

目前全球40岁以上的人群COPD发病率为9%～10%，并随着人口老龄化的加剧继续上升[11]。近年来，COPD在我国15岁以上人群的发病率为3%，在40岁以上人群中达到13.7%[12]。氧化应激、氧化抗氧化失衡和气道慢性炎症是COPD主要的发病原因。氧化抗氧化的失衡引起气道上皮、平滑肌及肺泡壁的损伤，造成气流受限[13]。然而，氧化抗氧化的失衡是否会导致炎症因子的释放，并导致气道慢性炎症的形成，目前并不十分清楚。

本研究结果显示，给予NAC治疗后炎症因子IL-6和IL-8较治疗前明显降低，提示抗氧化治疗可以降低COPD患者体内炎症因子的表达水平。IL-6和IL-8在COPD的发生发展中起重要的作用，其表达水平的降低预示疾病严重程度降低。动物实验证明：NAC可以使大鼠炎症减轻程度[14]。CALZETTA等[15]研究发现，采用人的分离的气道通过给予NAC可以降低脂多糖刺激后的炎症因子IL-6的表达，同时降低COPD急性加重的发生。

研究显示，给予NAC治疗后COPD患者的肺功能FEV1%pred增加，但相比基线差异无统计学意义(P>0.05)。有研究结果表明，连续服用NAC共3年患者的FEV1 下降幅度明显低于对照组，急性加重发生率和发作时间明显下降(P<0.05)，证明COPD患者长期服用NAC治疗能减缓肺功能的下降[16]。而ZHENG等[17]研究发现大剂量NAC(1200 mg·d-1)可以明显降低COPD急性加重的发生，但并没有发现对肺功能的影响。本研究没有观察到对急性加重的影响，但肺功能有所改善。COPD以气道和肺实质的慢性炎症为特征，通过释放多种炎症递质，激活炎症细胞，促进COPD的发生和发展[18]。NAC通过抑制上皮细胞及内皮细胞炎症递质的释放，减轻气道炎症，发挥潜在的抗炎作用[19-20]。而抗氧化作用通过降低COPD患者的炎症反应而延缓肺功能下降。

为进一步研究COPD中的氧化/抗氧化与气道慢性炎症反应之间的关系，笔者收集COPD患者的外周血，采用CSE刺激外周血淋巴细胞，并观察细胞培养中加入NAC后对炎症因子表达的影响，结果发现NAC可以降低CSE刺激后的炎症反应。CSE的刺激可以导致氧化应激，从而引发炎症反应，而且氧化应激导致的细胞及组织损伤可使炎症反应进一步加剧，如此发生一系列链式或链式支链反应[15]。

本研究从临床随机对照试验及体外细胞试验角度同时证实，抗氧化治疗可以通过降低COPD患者的炎症水平而发挥作用。