SPE-HPLC-DAD法同时检测柑橘药用资源中黄烷酮类和川陈皮素成分

谢 辉，陈 亚，雷爱玲，朱春燕，李杨梅，白玉婷，孙 鹏*，李贵节,2*

1重庆第二师范学院生物与化学工程学院 重庆市功能性食品协同创新中心，重庆 400067；2西南大学柑桔研究所 中国农业科学院柑桔研究所 国家柑桔工程技术研究中心，重庆 400712

柑橘属于芸香科柑橘亚科植物[1]，很多品种具有药用价值，常见中药材包括陈皮、青皮、化橘红、橘络及橘核等。陈皮(CitriReticulataePericarpium)为晒干的成熟橘皮，入药以陈为佳具有理气和中、燥湿化痰、安胃和中、降逆止呕等功效[2]。青皮(CitriReticulataePericarpiumViride)，即橘子未成熟的绿色干燥外皮，亦有用幼小果实晒干而成，具有破气散结、疏肝止痛的作用[3,4]。化橘红(ExocarpiumCitriGrandis)为广东地方柚的变种，具有利气消痰、宽中散结的功效[5,6]。橘络(CitriReticulataeRetinervus)即橘瓣上的白色丝络，具有通血脉、理气止痛及化痰的功效。橘核(CitriReticulataeSemen)为橘子的种子，具有理气、止痛的功效[7]。

柑橘果实中含有大量的类黄酮物质，常见成分包括属于黄烷酮类物质的芸香柚皮苷、橙皮苷、柚皮苷、橙皮素、柚皮素和属于多甲氧基黄酮类的川陈皮素[8]。已有研究表明，芸香柚皮苷、橙皮苷、柚皮苷等黄烷酮糖苷具有抗脂质过氧化、清除氧自由基、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒、延缓衰老、预防动脉粥样硬化等多种作用[9-11]；而川陈皮素也有较强的抗肿瘤、抗真菌、抗动脉粥样硬化和降低血清胆固醇等药理活性[12,13]。提取柑橘类黄酮的常用方法有碱提取酸沉淀法、溶剂提取法、超声波辅助提取、加热回流提取等方法；分离纯化的常用手段包括柱层析法、大孔树脂吸附法、高速逆流色谱技术等方法[14]。固相萃取(SPE)是近年来广泛应用于食品、生物、药学、环境等众多领域的样品前处理技术。SPE常用于处理组成复杂的液体样品，能够实现对样品中不挥发和半挥发性目标物的萃取、净化和浓缩的要求，具有去除干扰物质、溶剂用量少、操作简单快速等优良性能[15-20]。本研究选取了陈皮、青皮、化橘红、橘络、橘核等常用的柑橘药材作为检测对象，采用乙醇浸提柑橘药材中的川陈皮素和黄烷酮等目标物质，运用SPE进一步去除杂质和富集浓缩，采用高效液相色谱串联二极管阵列检测器(high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD)进行分离和分析检测，进而了解目标类黄酮成分在柑橘不同药用资源中的分布情况，以期为进一步研究其功能性和药理作用提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

陈皮、青皮、化橘红、橘络和橘核购自重庆万家燕大药房，由重庆第二师范学院重庆市功能性食品协同创新中心赵欣教授鉴定。甲醇、乙酸(色谱纯)上海阿拉丁有限公司；无水乙醇(分析纯)重庆川东化工(集团)有限公司。芸香柚皮苷、橙皮苷、柚皮苷、橙皮素、柚皮素及川陈皮素标准对照品(纯度98%) 上海源叶生物科技有限公司，其物质结构如图1所示。

图1 6个柑橘类黄酮标准物质结构式Fig.1 Chemical structures of six citrus flavonoids注：1-芸香柚皮苷；2-橙皮苷；3-柚皮苷；4-橙皮素；5-柚皮素；6-川陈皮素。Note:1-Narirutin;2-Hesperidin;3-Naringin;4-Hesperetin;5-Naringenin;6-Nobiletin.

1.2 仪器与设备

Ultimate 3000 高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器(DAD)，德国Thermo Scientific公司；HyperSep C18SPE小柱 ，德国Thermo Scientific公司；0.22 μm有机相微孔滤头，天津市津腾实验设备有限公司。

1.3 试验条件

1.3.1 标准工作溶液的配制

分别称取适量芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、川陈皮素标准品，用甲醇定容为1.0 mg/mL的储备液；再用甲醇稀释，配制浓度分别为10.0、15.0、20.0、30.0、100.0、200.0 μg/mL的标准工作溶液及相同浓度的混合标准液。

1.3.2 样品处理

样品粉碎后过60目筛，取约1.0 g细粉，精密称量，加入20 mL 70%(体积分数)乙醇，浸提1 h后过滤。将过滤后的液体稀释至5%，稀释液以1 mL/min流速通过甲醇活化后的固相萃取柱，再通过超纯水清洗除杂。柱上吸附的目标物质用5 mL甲醇洗脱，洗脱液过0.22 μm微孔滤膜后备用。

1.3.3 色谱及检测条件

色谱柱：Thermo Scientific Accucore C18(4.6 mm×150 mm，2.6 μm)；流动相：A甲醇，B 0.5%乙酸水溶液，流动相梯度见2.2分离条件的选择；定量检测波长：283、285、290、335 nm；柱温30 ℃；流速0.50 mL /min；进样量5 μL。

2 结果与讨论

2.1 浸提液稀释对C18固相萃取效果的影响

利用C18SPE前处理的原理为分配层析。柑橘类黄酮都含有极性较弱的母环结构，根据相似相溶的原理，它们依据取代基的不同易分布在中弱极性的物质中。当乙醇体积分数为70%的样品提取液通过SPE柱时，由于流动相与C18固定相极性接近，大部分黄烷酮类物质和川陈皮素会继续保留在乙醇溶液中，仅少量保留在SPE柱上。降低乙醇体积分数，得到的稀释液极性升高，则柑橘类黄酮物质更倾向于保留在极性更弱的固定相表面，从而能够实现固相萃取和浓缩。根据上述原理，将陈皮浸提液稀释至乙醇体积分数为20%、10%、5%，分别通过SPE柱，最终测得保留的类黄酮含量见表1。结果表明，5%体积分数乙醇稀释液中黄烷酮和川陈皮素被SPE收集保留量最高，效果最好。继续稀释时，类黄酮的溶解性显著降低，稀释液呈现明显浑浊状态，导致SPE对类黄酮成分的保留严重降低，且结果重复性差(结果未显示)。

表1 C18 SPE对不同乙醇浓度陈皮稀释液中类黄酮物质的收集保留量

2.2 色谱分离条件的选择

6种物质都含有苯并吡喃酮结构，性质较为相似，因此采用梯度洗脱的方式进行分离。考虑到黄烷酮类物质即芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、柚皮素和橙皮素中含有易电离的酚羟基，因此在流动相中加入乙酸抑制电离，从而改善峰型。实验发现，用甲醇和0.05%乙酸水溶液作为流动相，各物质不能达到基线分离，而且色谱峰仍有拖尾现象；改用甲醇和0.5%乙酸水溶液(pH=3.03)后，峰形得到明显改善，柑橘药用资源样品中的黄烷酮类物质能够实现良好分离。经优化后的洗脱程序见表2，在该条件下分离6种物质混合标准品和样品的的紫外色谱图如图2所示。

2.3 样品峰定性和定量检测波长选择

在2.2所述分离条件下，用DAD扫描各物质在190～400 nm间的紫外吸收，得到5个黄烷酮类物质及川陈皮素的紫外光谱图(图3)。将样品物质峰的保留时间和紫外光谱图与标准物质峰对比，实现对样品峰的定性分析，同时作峰纯度检测，以确认各目标物质峰没有或仅有微量其他成分共流出。由图3还可知：芸香柚皮苷在283 nm处有最大吸收，橙皮苷、柚皮苷在285 nm处有最大吸收，橙皮素、柚皮素在290 nm处有最大吸收，而川陈皮素在335 nm处有最大吸收。因此分别选择283、285、290、335 nm为上述6个物质的定量检测波长。

表2 HPLC流动相梯度洗脱程序

图2 柑橘类黄酮混合标准品色谱图和柑橘药用资源样品色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of the mixed flavonoid standard solution and citrus medicinal resources samples注：1-芸香柚皮苷；2-柚皮苷；3-橙皮苷；4-柚皮素；5-橙皮素；6-川陈皮素；A-陈皮；B-橘络；C-青皮；D-化橘红；E-橘核；显示波长：285 nm。Note:1-Narirutin;2-Naringin;3-Hesperidin;4-Naringenin;5-Hesperetin;6-Nobiletin;A-Chenpi;B-Juluo;C-Qingpi;D-Huajuhong;E-Juhe,;Ultraviolet wavelength:285 nm.

2.4 线性关系和检测限

将各标注物质储备液分别稀释至10.0、15.0、20.0、30.0、100.0、200.0 μg/mL，测量不同浓度的标样所对应的峰面积，计算回归方程。测定仪器信噪比(S/N)，当各标准溶液稀释至信噪比3

2.5 重复性、稳定性和精密度

取同一批实验样品按照1.3.2进行样品处理，配制试样6份，按照表2的流动相洗脱程序进行含量测定，进行精密度和重复性实验。结果显示各物质RSD在0.49%～2.55%(表4)，表明精密度和重复性良好。

将陈皮样品提取液放置于室温下，分别在24、48、72 h测定各类黄酮成分的含量，以研究其稳定性。如表5所示，提取液中芸香柚皮苷浓度呈缓慢地上升趋势，72 h升高了约1.7%；柚皮苷含量在72 h内呈缓慢下降趋势，约降低了0.02 mg/g。橙皮苷、柚皮素和橙皮素含量变化趋势不明显，而川陈皮素的含量在72 h内保持稳定。

表3 回归方程、相关系数及检测限

注：A为峰面积，单位mAU；C为浓度，单位μg/mL。

Note:A is the peak area in mAU;C is the concentration in μg/mL.

2.6 加标回收率实验

准确称取相同质量的同一批次陈皮样品两份，一份用来测定本底含量，另一份加入已知量的川陈皮素和黄烷酮类物质标准品，按照1.3.2项下的方法制备供试品溶液，按2.1、2.2项下条件测定，通过实际测得加入标准物质的量除以已知加入量计算回收率，并计算相对标准偏差，结果如表6所示，各物质的回收率为95.83%～103.56%。

图3 6个类黄酮标准品的紫外光谱图Fig.3 UV spectra of six flavonoids注：1-川陈皮素；2-芸香柚皮苷；3-橙皮苷；4-柚皮苷；5-橙皮素；6-柚皮素；横坐标为波长，单位nm；纵坐标为紫外信号的相对响应值。Note:1-Nobiletin;2-Narirutin;3-Hesperidin;4-Naringin;5-Hesperetin;6-Naringenin;the abscissa is the wavelength in nm;the ordinate is the relative response of the ultraviolet signal.

表4 重复性实验结果

2.7 柑橘药用资源类黄酮含量

将5种柑橘药用资源按照1.3.2和1.3.3处理和分析，结果如表7所示。所选柑橘药用资源均含有芸香柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素等4个黄烷酮类成分和川陈皮素；除橘核外，其他4种柑橘药用资源中都检出了柚皮苷。不同药用资源所含优势黄烷酮化合物的类别有所差异。陈皮、青皮、橘络和橘核中的优势成分是芸香柚皮苷和橙皮苷，其中以青皮中芸香柚皮苷含量最高(10.49 mg/g)，约为含量最低的橘核的40倍；陈皮中的橙皮苷含最高(10.78 mg/g)，是含量最低的橘核的10.5倍、化橘红的3.6倍。化橘红的优势黄烷酮物质为柚皮苷，其含量也为5种柑橘药用资源中最高的，达到19.20 mg/g，是含量最低的陈皮的137倍；橘核中未检出柚皮苷。

表5 稳定性实验结果

表6 加标回收率

表7 5种柑橘药用资源中黄烷酮类成分和川陈皮素的含量

3 结论

本研究开发了一套同时准确分析检测柑橘药用资源中黄烷酮类成分和川陈皮素等类黄酮物质含量的方法。采用70%乙醇浸提，将提取液稀释后通过固相萃取除杂并浓缩，采用高效液相色谱分离6种目标物质，利用紫外光谱结合保留时间做定性分析及色谱峰纯度检验，采用外标法在各物质的最大波长处测定其含量。结果表明：样品稀释液乙醇体积分数为5%时，利用SPE富集各类黄酮成分效率最高。对陈皮、青皮、化橘红、橘络和橘核等5种柑橘药用资源进行了分析，结果表明：青皮中芸香柚皮苷含量最高(10.49 mg/g)，化橘红中柚皮苷含量最高(19.20 mg/g)，陈皮中的橙皮苷含最高(10.78 mg/g)；而柚皮素、橙皮素、川陈皮素在各柑橘药用资源中含量较低。该方法的加标回收率为95.83%～103.56%，RSD为0.49%～2.55%，具有良好的精密度和重现性。该方法适用于常规HPLC对柑橘药用资源中类黄酮的定性和定量检测。