一测多评法测定不同产地黄柏炭中4种生物碱含量

罗 婷，王佳琪，江宇勤，范顺明，张春玲，余凌英

成都中医药大学 中药材标准化教育部重点实验室，成都 611137

黄柏为芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮，习称川黄柏[1]。其主要成分有小檗碱、黄柏碱、木兰花碱、巴马汀、药根碱等生物碱类[2]。黄柏炭炮制品，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮的功效，但黄柏炭清湿热之中兼有涩性，多用于便血，崩漏下血，在全国炮制规范和各地炮制规范均有收载[3-5]。2015年版《中国药典》以小檗碱，黄柏碱作为黄柏质量控制标准，尚不能反映黄柏炭的质量，且黄柏制炭后各类成分含量均有所变化，巴马汀成分几乎消失殆尽，含量最高的小檗碱部分转化为分解产物小檗红碱[6]。木兰花碱和小檗红碱是黄柏炭中的重要成分，应同时作为质量控制指标才更具有合理性。本实验以小檗碱为内参物，得出黄柏碱、木兰花碱、小檗红碱与小檗碱的相对校正因子，建立快捷、方便、全面、实用的一测多评法[7-10]，并对不同产地饮片进行质量控制，为其质量标准修订提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-2030C岛津高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Sartorius BS110S 十万分之一分析天平(德国赛多利斯公司)；KQ-300E 超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料

黄柏碱对照品(批号wkq18051608，四川省维克奇生物科技有限公司)；木兰花碱(批号wkq16050801，四川省维克奇生物科技有限公司)；小檗碱对照品(批号110713-201613，中国食品药品检定研究院)；小檗红碱(批号wkq16061402，四川省维克奇生物科技有限公司)均为纯度达到98%以上，可供含量测定用；其他试剂均为分析纯。实验用的30批黄柏炭样品信息表见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为SHIMADZU InertSustain-C18(4.6 × 250 mm，5 μm)；乙腈(A)-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(B)溶液为流动相，进行梯度洗脱：0～15 min，10%～14%A；15～35 min，14%～32%A；35～50 min，32%～40%A。进样体积为5 μL，检测波长为230 nm，柱温为35 ℃；流速0.8 mL/min。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取黄柏碱、木兰花碱、小檗红碱、小檗碱适量，分别制成浓度为23.5、30.5、102.4、125.6 μg/mL的对照品溶液，混合对照品及饮片样品图见图1。

图1 混合对照品溶液(A)和样品HPLC图谱(B)Fig.1 HPLC of reference substances (A) and samples (B)注：1黄柏碱；2木兰花碱；3小檗红碱；4小檗碱。Note:1 phellodendrine;2 magnolia;3 berberubine;4 berberine.

2.3 供试品溶液的制备

取黄柏炭样品粉末(过四号筛)约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)60 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2”下的混合对照品溶液0.5、0.8、1、2、5、10 mL置10 mL容量瓶中定容，制得6种不同浓度的混合对照品溶液。按照“2.1”下色谱条件进行测定，记录峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，浓度为横坐标做回归曲线方程，各成分在相应的浓度范围内线性关系良好。结果见表2。

2.5 精密度实验

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液各5 μL，分别重复进样6次，测定4种对照品各自的峰面积，结果黄柏碱、木兰花碱、小檗红碱、小檗碱峰面积RSD值分别为1.21%、0.54%、0.98%、1.18%表明仪器精密度良好。

表2 4种黄柏炭生物碱成分的线性关系考察

2.6 稳定性实验

取同一供试品溶液(S1)，分别于0、3、6、12、24、48 h进样5μL，测定并记录峰面积。结果黄柏碱、木兰花碱、小檗红碱、小檗碱RSD分别为1.72%、1.86%、1.09%、1.53%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.7 重复性实验

取同一批样品6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样5 μL，在“2.3”色谱条件下进行测定并记录峰面积。计算得到黄柏碱、木兰花碱、小檗红碱、小檗碱的RSD分别为0.58%、1.61%、1.09%、0.84%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率实验

取6份已知含量的样品0.2 g，精密称定，按加入的样品中黄柏碱、木兰花碱、小檗红碱、小檗碱的含量比对照品含量比例为1∶1，分别精密加入对照品溶液。按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下分析，测定峰面积，计算回收率，结果表明黄柏碱、木兰花碱、小檗红碱、小檗碱平均加样回收率分别为98.3%、100.5%、99.8%、102%，RSD分别为2.04%、1.58%、2.12%、1.28%，说明该方法准确度良好(见表3)。

表3 加样回收率计算结果(n=6)

3 相对校正因子计算及耐用性考察

3.1 相对校正因子计算

取混合对照品溶液分别进样2、4、6、8、10、20 μL，按公式fk/m=fk/fm=Wk×Am/(Wm×Ak)[11]，式中Ak为内标物峰面积，Wk为内标物质量或浓度，Am为其他组分m的峰面积，Wm为其他组分的质量或浓度。以小檗碱为内参物，计算黄柏碱、木兰花碱、小檗红碱的校正因子。结果见表4。

表4 黄柏炭3种生物碱成分相对校正因子

3.2 待测组份色谱峰定位

利用4个成分色谱行为的不同，以小檗碱为基准峰，计算各个成分的相对保留值、保留时间差，确定其在色谱图中的位置。结果见表5。

由表5可知，相对保留值RSD ≤ 5%，保留时间差差异较小。通过相对保留值可准确判断目标峰的准确峰位置。

表5 黄柏炭3种生物碱成分相对保留值和保留时间差

3.3 考察不同色谱柱及高效液相色谱仪对校正因子和相对保留时间的影响

在两种不同的仪器上考察了3个品牌色谱柱对校正因子的影响， 结果表明：不同品牌色谱柱对校正因子和相对保留时间无明显影响，结果见表6。

表6 不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响

续表6(Continued Tab.6)

仪器Instrument色谱柱Chromatographic column相对校正因子Relative correction factor相对保留值Relative retention valuef(小檗碱/黄柏碱)f(Berberine/Phellodendrine)f(小檗碱/木兰花碱)f(Berberine/Magnolia)f(小檗碱/小檗红碱)f(Berberine/Berberubine)T(小檗碱/黄柏碱)T(Berberine/Phellodendrine)T(小檗碱/木兰花碱)T(Berberine/Magnolia)T(小檗碱/小檗红碱)T(Berberine/Berberubine)Angilent1260InertSustain0.336 00.311 00.978 30.489 00.506 40.931 2Global Chromatagraphy0.348 90.307 90.965 90.516 50.511 40.908 3Kromasil0.328 10.309 81.010 90.469 30.508 40.942 2平均值Average0.336 60.310 50.986 60.488 70.509 40.940 9RSD%2.271.072.773.671.563.06

3.4 考察不同柱温、波长、流速对校正因子的影响

在同一色谱条件下，考察25、30、35 ℃三个柱温、215、230、245 nm 三个波长、考察0.6、0.8、1 mL/min三个体积流量对校正因子的影响，由表5可知柱温、波长、流速的变化对相对校正因子的影响不大。结果见表7。

表7 不同柱温对相对校正因子的影响

4 不同产地黄柏炭测定结果

按供“2.3”项下方法制备样品，分别精密吸取供试品溶液各5 μL注入高效液相色谱仪测定。采用外标法和一测多评法分别测定含量，结果见表8。

测定结果表明，外标法与一测多评法测得的含量无明显差异，说明该方法测定结果具有较高可信度。不同产地黄柏经炭制后4种生物碱成分含量具有明显的区别，其中荥经县的黄柏炭炮制品成分含量相对较高。

5 结论

现代研究发现，黄柏经炒炭后有21种化学成分在炮制前后具有明显的差异[12]。因此单一成分作为质量控制指标不够全面。黄柏在炒炭过程中，随着炮制时间延长，小檗碱质量分数逐渐减少，而小檗红碱质量分数逐渐增加，据此推测，小檗碱在加热过程中可脱去一个甲基转变为小檗红碱[13]，且小檗红碱在4种生物碱含量中仅次于小檗碱，因此增加其作为一测多评法测定指标之一。本实验引入一测多评法，实现黄柏炭4种生物碱成分的同时测定，对现有质量控制方法进行提升，使其更快捷、方便、全面。

表8 不同地区黄柏炭4种生物碱测定结果

本实验考察了不同柱温、流速、色谱柱、液相色谱系统对小檗碱与黄柏碱、木兰花碱、小檗红碱之间相对校正因子的影响，验证一测多评法在黄柏炭质量控制中的可行性和适应性。在不同流速的考察过程中，3种流速对于混合对照品均无明显影响，但是黄柏炭样品中成分较多，不同的流速对黄柏炭样品具有较大影响。在对比了3种流速下黄柏炭样品峰的基线、分离度、对称因子等因素后，最后选择采用流速0.8 mL/min作为本实验中HPLC流速。

本实验选择的30批黄柏均来源于四川。四川作为黄柏的主要产区，在中国国内的生产和销售都占有举足轻重的地位。30批黄柏炭中，以荥经县的黄柏炭炮制程度最好，各成分含量也相对较高。黄柏炒炭后，外观性状和内在成分变化明显，且所购黄柏炭饮片也因此难以做到炒炭程度统一，因此对于炮制工艺参数的研究也极为重要。本实验通过对各主要有效成分的精确定量测定，为黄柏炭质量的控制和评价提供更好技术参考，同时为本课题接下来进一步研究黄柏炭的炮制工艺参数奠定基础。