基于网络药理学的谷糠结合态多酚抗乳腺癌机制研究

李帅涛，张立超，剌晓琴，李爱平，武海丽，李卓玉,2,*

1山西大学生命科学学院；2山西大学生物医学研究院；3山西大学生物技术研究所；4山西大学中医药现代研究中心，太原 030006

谷子(Setariaitalica)，学名栗，是我国传统优势作物，含有丰富的蛋白质、维生素和微量元素，具有很高的营养价值，在我国广泛种植[1]。而谷糠作为谷子加工过程中的副产品，往往被人们所忽视，有研究表明谷糠含有丰富的植物化学物质，如多酚等，具有广泛的生物学特性和药理反应[2]。有研究表明植物多酚具有抗氧化、调控细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡等，从而抑制癌细胞的增殖[3]。

乳腺癌是我国女性最常见的恶性肿瘤之一，主要由乳腺导管上皮出现恶性改变而发生[4]。近年来，乳腺癌发病率不断增加，已经严重威胁了我国女性的身心健康[5]。乳腺癌的发生有许多内源和外源的因素参与其中，是一个长期的、多因素的过程[6]。目前，手术及放化疗仍是治疗乳腺癌的主要方式，但治疗过程往往带来严重的副作用[7]。本课题组前期研究发现BPIS对人肝癌细胞、宫颈癌细胞以及结直肠癌细胞等多种癌症细胞均有显著的抑制作用[8]，尤其能够显著抑制乳腺癌细胞的活性，但对正常乳腺细胞没有明显影响，因此探明其具体作用机制将扩展临床治疗手段，减轻副作用，对乳腺癌的治疗具有重要意义。

网络药理学能够通过计算机模拟算法、运用组学、高通量筛选及网络分析等技术揭露药物-靶点-疾病之间复杂的网络信号关系，已经成为揭示生物系统复杂功能和行为的有力工具[9]。网络药理学从系统生物学和生物网络角度对药物的作用机制进行整体分析，具有高通量、快速、灵敏和准确的特点[10]。因此运用网络药理学对BPIS抗乳腺癌作用的靶点与通路进行筛选，构建BPIS的成分-靶点-疾病网络模型，从系统生物学的角度对BPIS抗乳腺癌的可能作用机制进行整体阐释，为后续具体作用机制的研究以及特殊医药食品的开发提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

谷子品种为晋谷21号，产地为山西省晋中市，由山西省天下谷公司提供。人乳腺癌细胞MDA-MB-231(南京恩晶生物科技有限公司)；人乳腺癌细胞MCF-7和正常乳腺细胞MCF-10A(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)；RPMI-1640 Medium培养基、DMEM/F-12培养基和DMEM High Glucose培养基(山西百奥生物技术有限公司)；青链霉素(100X，北京索莱宝科技公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；胰蛋白酶(北方同正公司)；CO2细胞培养箱(Eppendorf Galaxy 170S)；倒置显微镜(Zeiss，德国)。

1.2 BPIS对乳腺癌细胞活性检测

人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231和人正常乳腺细胞MCF-10A均培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青链霉素的培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。等到细胞长满贴壁，用胰酶消化、1 000 rpm离心制成细胞悬液，接种到12孔板中，细胞浓度为1×105/孔。细胞贴壁后弃掉培养基，加入1 mL含BPIS的新培养基，BPIS浓度为2、4、8 μg/mL。加药处理24 h后，在显微镜下观察细胞形态，并用血球计数板进行计数。

1.3 BPIS活性成分的鉴定

称取一定量的谷糠，用80%的预冷丙酮室温搅拌2 h(谷糠，丙酮物料比为1∶20)，静置20 min后弃上清，用NaOH(2 mol/L)于室温下搅拌1 h(物料比1∶10)。加适量HCl终止消化，调节PH为7。11 000 rpm，离心5 min，取上清。上清中加入乙酸乙酯(乙酸乙酯∶上清=1∶1)进行脱脂，静置10 min，11 000 rpm，离心10 min，取上清，重复操作5次。将得到的多酚于旋转蒸发仪上45 ℃旋转蒸发，将旋转蒸发后的液体用100D透析袋透析除盐，真空冷冻干燥，即可得到谷糠结合态多酚。

本课题组在前期实验中采用大孔树脂柱对BPIS成分进行分离纯化，使用旋转蒸发仪浓缩至一定体积、真空冻干至粉末，用甲醇配置成溶液，通过超高效液相色谱-高分辨飞行质谱连用仪(UPLC-Triple-TOF/MS)对BPIS中主要成分进行了鉴定[11]。

1.4 BPIS作用靶点预测

将整理得到的BPIS活性成分，导入PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中，得到Smiles化学式并下载其3D分子结构式，保存为SDFile(.sdf)格式。将BPIS活性成分对应的Smile化学式输入到SEA (http://sea.bkslab.org/) 数据库中，得到作用靶点。DRAR-CPI(https://cpi.bio-x.cn/drar/)是一种反向分子对接服务器，服务器以对接得分(Z′-score)表示活性成分与蛋白质间相互作用强度，规定Z′-score<-0.5时活性成分与靶点有结合的可能性[12]。登陆DRAR-CPI服务器，上传BPIS活性成分的.sdf格式文件，为了提高预测准确度，选取Z′-score<-1的靶点作为药物潜在靶点。将筛选到的靶点PDB ID导入UniProt数据库，转化为GeneCards数据库对应的基因名称(Gene name)。为了提高靶点的准确性，对两个数据库得到的作用靶点进行整理，作为BPIS潜在的作用靶点。

1.5 乳腺癌相关靶点预测

通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和HOME-NCBI-GENE (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，输入关键词“Breast cancer”，设置物种为人，进行检索，得到与乳腺癌相关的潜在靶点。

1.6 蛋白相互作用网络构建与分析

将预测得到的BPIS 潜在作用靶点与乳腺癌相关靶点进行匹配，得到BPIS抗乳腺癌的潜在作用靶点。将靶点信息导入String 数据库(https://string-db.org/)[13]，设置物种为人，获取蛋白相互作用关系，将结果保存为TSV格式文件。从文件中获取node1、node2和Combined score相关信息，并导入Cytoscape version软件，制作蛋白相互作用网络，并进行分析。将节点大小和颜色与degree的大小关联，将边的粗细与combine score的大小关联，建立靶点蛋白相互作用网络。

1.7 活性成分-蛋白靶点网络构建与分析

将BPIS活性成分和抗乳腺癌潜在靶点导入Cytoscape version软件，构建BPIS活性成分-抗乳腺癌靶点相互作用网络。

1.8 GO和KEGG富集分析

将BPIS抗乳腺癌潜在靶点导入DAVID数据库(https://david. ncifcrf.gov/)，将列表和背景物种限定为人，进行GO分析和KEGG通路富集分析。本研究选择GO分析中生物过程(BP，biological process)、分子功能(MF，molecular function)和细胞成分(CC，cell component)3个模块对基因功能进行注释，并设置阈值P<0.05，按照靶点数目筛选排名靠前的生物功能和通路，并进行绘图。

2 结果

2.1 BPIS对乳腺癌细胞活性有明显抑制作用

利用浓度梯度的BPIS处理乳腺癌细胞24 h，细胞形态发生了显著的改变，如图1所示，MCF-7和MDA-MB-231细胞由原来的长梭形逐渐变圆，并且皱缩，发生明显的死亡现象，而对照组MCF-10A形态无明显变化。随后，利用血球计数板对细胞进行计数，并统计其存活率，结果如图2所示，MCF-10A与对照组相比无明显变化，而MCF-7和MDA-MB-231细胞经浓度为8 μg/mL的BPIS处理24 h，细胞存活率显著降低，表明BPIS对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的生长有显著抑制作用，而对正常乳腺细胞作用不明显。

2.2 BPIS活性成分及靶点预测

通过前期对BPIS组分的鉴定，并以鉴定出的活性成分和癌症为关键词在PubMed进行文献检索，去除检索结果为0的活性成分，整理得到8个BPIS化学成分，详见表1。将BPIS活性成分导入SEA数据库和DRAR-CPI服务器，并选取Z′-score<-1，删除重复数据，整理得到577个作用靶点。对GeneCards数据库和HOME-NCBI-GENE数据库检索结果进行整理，得到乳腺癌相关靶点1676个。将BPIS作用靶点与乳腺癌靶点进行匹配，整理得到39个BPIS抗乳腺癌潜在靶点，详见表2。

2.3 蛋白相互作用网络构建与分析

将筛选得到的39个潜在靶点导入String 数据库，选择物种为“Homo sapiens”检索得到蛋白相互作用关系网络，结果保存为TSV格式文件，将文件中node1、node2和Combined score相关信息导入Cytoscape version软件绘制蛋白相互作用网络，详见图3。

图中节点(node)代表作用靶点，节点的大小代表该靶点作用强度，靶点的degree等级越高，节点越大，对应的颜色由绿到红逐渐加深。其中边(edge)表示靶点之间的关联，边的粗细代表靶点间关联的大小，靶点间Combine score 值越大，靶点间结合度越高，边越粗。图中共有39个节点，286条边，平均节点度为14.7，平均局部聚类系数为0.694。其中靶点RHOA与MAPK8、靶点EGFR与CCND1和靶点PTGS 2与VEGFA相连的边较粗，说明结合程度较大。同时，靶点INS、ESR1、HRAS和MAPK1的节点较大，说明 degree等级较大，预测以上靶点可能发挥主要作用。胰岛素(INS)是由β细胞受内源性或外源性刺激，而分泌的一种蛋白质激素，能够促进糖原、脂肪和蛋白质的合成，最新医学数据显示，糖尿病及糖脂代谢障碍与许多恶性肿瘤的发生有密切的关联[14]。HRAS属于RAS家族的小GTP酶，是癌症中经常发生突变的致癌基因，HRAS调节复杂的信号转导网络，包括RAF-MEK-ERK级联、VEGF-PI3K-AKT途径和Raf-1信号转导来促进癌细胞的增殖、迁移、血管生成和自噬等发生[15]。MAPK1是一类丝裂原活化蛋白激酶，据研究报道，MAPK1参与了细胞的自噬、脂代谢、增殖、迁移和侵袭等过程[16,17]。可以预测BPIS主要通过对细胞的增殖、迁移、自噬和糖脂代谢的调控来发挥抗乳腺癌作用。

图2 BPIS对乳腺癌细胞活性的影响(n=3, x±s)Fig.2 Effect of BPIS on the activity of breast cancer cells (n=3, x±s)注：*P<0.05，**P<0.01。Note: *P<0.05, **P<0.01.

表1 BPIS中活性成分

表2 BPIS活性成分抗乳腺癌潜在靶点

续表3

序号No.基因名称Gene nameUniProt ID蛋白名称Protein name程度Degree介数Betweeness7ABCB1P08183多药耐药蛋白1Multidrug resistance protein 150.067 812 618PTGS2P35354前列腺素G / H合成酶2Prostaglandin G/H synthase 230.001 852 249GSTM1P09488谷胱甘肽s转移酶Mu 1Glutathione S-transferase Mu 140.006 722 4510SERPINE1P05121纤溶酶原激活物抑制剂-1Plasminogen activator inhibitor 120.008 759 8611MAPK1P28482丝裂原激活蛋白激酶1Mitogen-activated protein kinase 11012GSTT1P30711谷胱苷肽S转移酶T1Glutathione S-transferase theta-160.043 502 8213GSTP1P09211谷胱甘肽巯基转移酶Glutathione S-transferase P30.003 121 2214CD44P16070CD44抗原CD44 antigen1015ESR2Q92731雌激素受体βEstrogen receptor beta30.000 815 2516RELAQ04206转录因子p65Transcription factor p6530.001 852 2417GSK3BP49841糖原合成酶激酶-3Glycogen synthase kinase-3 beta1018CYP1A1P04798细胞色素P450 1ACytochrome P450 1A130.031 687 8519PARP1P09874聚[adp -核糖]聚合酶1Poly [ADP-ribose] polymerase 11020MMP1P03956间质胶原酶Interstitial collagenase30.000 815 2521RHOAP61586转化蛋白RhoATransforming protein RhoA60.013 908 0722PTK2Q05397局灶性粘附激酶1Focal adhesion kinase 11023MAPK8P45983丝裂原激活蛋白激酶8Mitogen-activated protein kinase 81024IGFBP3P17936胰岛素样生长因子结合蛋白3Insulin-like growth factor-binding protein 330.002 434 225HDAC1Q13547组蛋白脱乙酰酶1Histone deacetylase 140.003 614 4826FGFR1P11362成纤维细胞生长因子受体1Fibroblast growth factor receptor 11027CYP1B1Q16678细胞色素P450 1B1Cytochrome P450 1B150.067 845 628PLAUP00749尿激酶型纤溶酶原激活剂Urokinase-type plasminogen activator1029HRASP01112GTP酶HRasGTPase HRas20.008 759 8630MGMTP16455甲基鸟嘌-DNA-甲基转移酶Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase70.054 731 7531ERBB3P21860酪氨酸激酶erbB-3Receptor tyrosine-protein kinase erbB-31032EP300Q09472组蛋白乙酰转移酶p300Histone acetyltransferase p30040.003 614 48

续表3

序号No.基因名称Gene nameUniProt ID蛋白名称Protein name程度Degree介数Betweeness33SHBGP04278性激素结合球蛋白Sex hormone-binding globulin20.000 846 4134ABCC1P33527多药耐药相关蛋白1Multidrug resistance-associated protein 120.018 645 0535INSP01308胰岛素Insulin1036CDK2P24941细胞周期蛋白依赖性激酶2Cyclin-dependent kinase 21037IL2P60568白细胞介素-2Interleukin-220.008 759 8638RARBP10826维甲酸受体Retinoic acid receptor beta60.013 908 0739CCNB1P14635G2 /有丝分裂特异性细胞周期蛋白B1G2/mitotic-specific cyclin-B110

图3 BPIS蛋白相互作用网络Fig.3 Protein interaction network of BPIS．注：节点的颜色和大小代表作用强度，边的粗细代表结合度。Note: The size and the color of the node represents the value of the degree, the thickness of the side indicates the value of the combine score.

2.4 BPIS活性成分-作用靶点网络构建

将BPIS活性成分和作用靶点相关信息导入Cytoscape version软件，构建活性成分-作用靶点网络图，详见图4。图中共有47个节点，107条边，其中菱形绿色的节点代表BPIS活性成分，圆形红色的节点代表相关靶点。由图中可以看出，活性成分Vitexin对应22个靶点，靶点MGMT对应了7个活性成分，体现了BPIS多成分、多靶点的调节特点。

图4 BPIS活性成分-靶点相互作用网络Fig.4 Components-targets network of BPIS 注：绿色棱形代表BPIS主要活性成分，红色圆形代表BPIS抗乳腺癌潜在靶点。Note: The green diamond is the main active components of BPIS，the red circle is the potential anti-breast cancer targets of BPIS.

2.5 GO和KEGG富集分析

将BPIS活性成分对应的靶点信息导入DAVID数据库，进行GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析。根据分析结果设置阈值P<0.05，筛选得到12个生物过程，如图5所示，分别为RNA聚合酶II启动子转录正调控、药物反应、信号转导、MAPK级联反应、GTP酶活性激活正调控、血管生成、细胞增殖负调控、蛋白磷酸化、细胞凋亡正调控、PI3K信号传导正调控、ERK1和ERK2级联正调节及细胞多脂多糖反应。细胞成分的分析结果如图6所示，靶点主要涉及核、细胞质、质膜和胞液等。靶点涉及的分子功能如图7所示，主要有蛋白质结合、ATP结合、酶结合及蛋白激酶活性等。其中蛋白激酶是催化蛋白质磷酸化过程的酶，在肿瘤细胞中有重要的作用。蛋白激酶Mst是在体内普遍表达的一种苏氨酸蛋白激酶，研究发现激活Mst活性可以引起细胞凋亡[18]。

图5 GO生物过程富集分析Fig.5 Gene Ontology (GO) analysis of Biological process

图6 GO细胞成分富集分析Fig.6 Gene Ontology (GO) analysis of cell component

图7 GO分子功能富集分析Fig.7 Gene Ontology (GO) analysis of molecular function

KEGG通路富集分析(图8)发现，这些靶点主要涉及癌症信号通路(pathways in cancer)、蛋白多糖在癌症中的作用(proteoglycans in cancer)、PI3K-AKT信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)、Ras信号通路(Ras signaling pathway)和ErbB信号通路等。粘蛋白(MUC1)是一种与肿瘤相关的糖蛋白，在90%的乳腺癌中高表达，且与乳腺癌患者的瘤负荷量成正比，以MUC1为乳腺癌治疗的靶点可以有效的杀伤乳腺癌[19]。PI3K/AKT(丝氨酸/苏氨酸激酶)信号通路可以通过促进细胞生长、迁移和增殖、减少凋亡等途径促进乳腺癌肿瘤的形成，有研究表明使用小檗碱可以通过抑制AKT-mTOR信号通路，从而诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞自噬及凋亡[20]。以上结果与文献基本一致，表明了BPIS活性成分的相关靶点分布在不同的代谢通路，体现了BPIS多成分、多靶点协同抗乳腺癌的作用机制。

图8 BPIS相关靶点的KEGG代谢通路富集分析Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis of BPIS potential targets

2.6 靶点通路分析

利用DAVID数据库对BPIS相关靶点进行KEGG通路富集分析，并整合绘制出最终的通路图。如图9所示，将BPIS抗乳腺癌相关靶点标记为浅绿色，通路靶点标记为浅蓝色。图中显示了EGFR/MAPK、EGFR/Ras、RhoA、INS/PI3K-AKT、CD44和VEGF信号通路可能参与了BPIS对乳腺癌细胞活性的调节。EGFR是一种具有内在蛋白酪氨酸激酶活性的跨膜受体蛋白，其活化会导致广泛的生物反应，涉及细胞的凋亡、迁移和增殖等，而三阴性乳腺癌的特征在于EGFR的过表达和其下游信号传导途径的激活；有研究发现使用单克隆抗体西妥昔和一种酪氨酸酶激酶抑制剂对EGFR进行双重靶向治疗，能够对MAPK和RAS信号通路进行抑制，可能成为三阴性乳腺癌的潜在治疗方法[21,22]。PI3K/AKT信号通路在乳腺癌中往往是被激活的，且有研究发现，通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，能够通过促进分子伴侣介导的自噬，从而抑制细胞的增殖并促进细胞的凋亡[23,24]。CD44是哺乳动物细胞表面上普遍存在的糖蛋白，研究发现其在多种实体肿瘤如：乳腺癌、肺癌和胰腺癌中高度表达[25]。实体瘤的进展取决于恶性组织中血管的形成，在一系列促血管生成因子中，血管内皮生长因子VEGF起着关键作用，VEGF的阻断可导致血管网络的消退并抑制肿瘤的生长[26]。其中EGFR/MAPK和INS/PI3K-AKT都与糖脂代谢的调节有密切联系，同时分析结果显示，与上述信号通路联系最密切的死亡相关过程只有自噬，表明BPIS很可能通过调节乳腺癌细胞中的糖脂代谢促进其自噬性死亡，从而发挥特异性的抗乳腺癌作用。

图9 BPIS抗乳腺癌潜在靶点通路分析Fig.9 Potential anti-breast cancer pathways of BPIS

3 结论

谷糠虽然是谷物加工过程中的副产品，但它含有丰富的营养元素和活性物质，其中谷糠结合态多酚具有较高的生物活性，包括抗氧化、抗高血糖、抗肿瘤和免疫调节等作用[27]。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，三阴性乳腺癌是较特殊的类型，具有恶性程度高、侵袭能力强等特点，目前缺乏有效的治疗手段[28]。我们研究发现，BPIS对乳腺癌细胞具有特异性杀伤作用。本文通过网络药理学方法，对BPIS发挥抗乳腺癌作用的机制进行系统的分析和预测，为进一步深入研究BPIS抗乳腺癌作用提供了扎实的理论依据。

富集分析结果显示，BPIS主要参与调控药物反应、信号转导、MAPK级联反应、蛋白磷酸化等生物过程；涉及核、细胞质、质膜和胞液等细胞组分；涉及蛋白质结合、ATP结合、蛋白激酶活性等分子功能。靶点通路富集分析结果显示：12个靶点参与PI3K-AKT信号通路(30.8%)、9个靶点参与FoxO信号通路(23.1%)、9个靶点参与Ras信号通路(23.1%)、7个靶点参与ErbB信号通路(17.9%)，其中FoxO信号、MAPK信号、PI3K/AKT信号以及INS信号都与糖脂代谢以及细胞自噬存在显著相关性。

有研究表明胃癌组织中，自噬相关基因LC3和FoxO表达水平显著增高[29]，且FoxO的磷酸化有助于三酰甘油转运蛋白MTP的表达和极低密度脂蛋白VLDL的产生，促进脂类的转运[30]。然而p38MAPK、PI3K/AKT和FoxO1的磷酸化水平与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1的表达呈负相关，其磷酸化减弱后能够促进自噬的发生[31-33]。同时有研究表明脂代谢相关基因FTO在乳腺癌细胞中高度表达，用FTO抑制剂处理后，乳腺癌细胞中PI3K/AKT表达水平明显降低，说明PI3K/AKT信号参与了乳腺癌细胞中的脂质代谢[34]。结合相关文献报道以及本研究所做的相关分析，我们推测BPIS可能通过阻断脂质转运以及代谢，使细胞内脂质代谢紊乱，导致PI3K/AKT和FoxO等信号的减弱，从而引发细胞自噬，过度的自噬导致正常的细胞功能受损以及进一步的细胞死亡。由于肿瘤细胞本身就存在较强的自噬活动，BPIS的进一步诱导使其很容易达到自噬性死亡的最大阈值，这可能也是BPIS对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用的重要原因。

综上所述，网络药理学结果显示BPIS中8个活性成分作用于39个靶点，涉及了多个生物过程、分子功能和细胞成分。通过对蛋白相互作用网络和BPIS活性成分-靶点网络的构建，发现靶点之间，活性成分和靶点之间存在相互作用关系，体现了特殊医药食品多成分-多靶点-多途径的作用特点。这一研究将为深入探讨BPIS抗乳腺癌的作用机制以及进一步的开发利用提供科学依据。