猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及应用

杨永能

（云南省楚雄彝族自治州动物疫病预防控制中心，云南楚雄 675000）

猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是世界范围的猪病，给养猪业带来了严重的经济损失。为有效地预防和控制该病，建立一种快速、灵敏又特异的检测方法势在必行。目前，国内诊断该病的方法大多是采用细菌分离鉴定和血清学诊断，细菌分离鉴定费时、费力、过程繁琐且有时分离不到致病菌；血清学诊断虽然简便、快速，但有其局限性，如亚临床感染或带菌状态下易造成假阴性，对免疫猪和感染猪不能做出有效的鉴别诊断。猪传染性胸膜肺炎有15个血清型，目前，虽然已建立了以胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP） APXI、APXII、APXIII及OMP等某一DNA片段为目标基因的PCR诊断方法，但与胸膜肺炎放线杆菌相近的菌属较多，且也存在这些目标基因或者与目标基因差别极小的基因片段，在进行PCR扩增时，偶尔会出现假阳性，造成误诊。APXIVA基因与APXI、APXII、APXIII基因不同，APXI、APXII、APXIII等基因只存在于部分血清型的胸膜肺炎放线杆菌中，APXIVA则存在于所有血清型中。据报道，以放线杆菌所有的15个血清型菌株为模板，用PCR方法都能扩增出APXIVA片段，而从其他亲缘关系相近的细菌中无法扩增出这一片段，说明该片段具有很高的种属特异性。以APXIVA基因某一DNA片段为目标基因建立PCR诊断方法，有利于疾病发生时的快速诊断和流行病学调查，具有广阔的应用前景和实用价值。

1 试验材料与方法

1.1 菌株来源

标准菌株：传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型2型和5型标准菌株和副猪嗜血杆菌菌株购自中国兽医药品监察所微生物菌种保藏中心。分离菌株和对照菌株（链球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌）均由云南农业大学动物医学院实验教学中心提供。

1.2 试验设备

高压锅、超净台、冰箱、恒温培养箱、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳仪、琼脂糖凝胶成像系统、移液枪、水浴锅、离心管、显微镜、载玻片等由云南农业大学动物医学院实验教学中心提供。

1.3 试验材料及试剂

还原型辅酶A、巧克力琼脂培养基、PPLO琼脂培养基、脲酶、触酶、七叶苷、水杨苷、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、海藻糖等均由云南农业大学动物医学院实验教学中心提供。2×Trans HiFi MixⅡ、dNTP购自大连宝生物技术服务有限公司。

1.4 引物的设计与合成

根据 Nahuel和 Alain等[2，3]报告的 APXIVA 基因序列，针对目前主要流行的血清型设计出一对特异性引物，并提交上海生工生物技术服务有限公司合成。

2 试验步骤

2.1 DNA提取

分别取传染性胸膜肺炎放线杆菌、链球菌、巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌标准菌株菌液1.5 mL。于12 000 rpm离心1 min，弃上清，根据上海生工生物技术服务有限公司细菌总DNA抽提试剂盒进行细菌的DNA提取，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取情况，阳性DNA则于- 20℃保存备用。

表1 引物序列

2.2 PCR体系及反应条件优化

利用提取的传染性胸膜肺炎放线杆菌标准菌株DNA作为模板，对PCR反应体系及条件进行优化，经多次试验摸索和优化，最终确立最佳PCR反应体系和条件分别为：

⑴第1轮PCR反应（外链扩增）体系及条件（扩增条带为442 bp）：

表2 第1轮PCR反应的PCR扩增体系

第1轮PCR反应（外链）扩增程序为：①94℃预变性5 min，②94℃变性30 s，③52℃退火30 s，④72℃延伸30 s，进行35个循环，⑤72℃延伸5 min。

⑵ 第2轮PCR反应（内链）扩增体系及条件（扩增条带为378 bp）：

表3 第2轮PCR反应的PCR扩增体系

第2轮PCR反应（内链）扩增程序为：①95℃预变性5 min，②94℃变性30 s，③52℃退火30 s，④72℃延伸30s，进行35个循环，⑤72℃延伸5 min。

取10 μL PCR扩增产物与6×Loading Buffer混合均匀后加样到1.5%琼脂糖凝胶（含0.2%EB）孔中，并在100 V电压下电泳40 min，在凝胶成像系统上观察结果，并拍照。

2.3 PCR特异性测定

分别用与呼吸道有关的病原菌（链球菌、巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌和大肠杆菌）作为模板，按上述相同方法进行PCR扩增，观察电泳结果。

2.4 PCR灵敏性检测

分别挑取传染性胸膜肺炎放线杆菌标准菌株血清型2型和血清型5型接种于液体培养基中，37℃震荡培养24 h后；取0.2 mL菌液加1.8 mL PBS液混匀稀释后作为第1管，从第1管中取0.2 mL菌液加1.8 mL PBS液混匀稀释后作为第2管，从第2管中取0.2 mL菌液加1.8 mL PBS液混匀稀释后作为第3管……依次往下（10倍稀释）稀释至第8管。分别从稀释好的各管中取出1 mL，用上述所建的检测方法对其进行检测，观察电泳结果。并用核酸定量仪测定各管中菌液的浓度。

2.5 PCR检测方法的实际应用

对云南各地送检的7份疑似传染性胸膜肺炎感染的病料采用细菌分离生化鉴定方法及上述所建的PCR检测方法进行检测，比较所建的PCR检测方法与细菌分离生化鉴定法的符合率。

3 试验结果

3.1 细菌DNA的提取

将放线杆菌血清型2型和5型标准菌株及放线杆菌地方流行毒株提取后的DNA进行电泳检测，确定已抽提出DNA。

3.2 第1轮 （外链扩增）和第2轮 （内链扩增）PCR反应的优化

利用提取的传染性胸膜肺炎放线杆菌标准菌株和地方流行株DNA作模板，对PCR反应体系及条件进行优化，经多次试验和优化，最终确立第1轮最佳PCR反应并扩增出442 bp条带（图1），第2轮最佳PCR反应并扩增出378 bp条带（图2）。

图1 菌株第1轮PCR产物电泳鉴定结果

图2 菌株第2轮PCR产物电泳鉴定结果

3.3 PCR特异性测定

以链球菌、巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌以及大肠杆菌的DNA为模板进行PCR扩增，结果显示，2对引物只能对传染性胸膜肺炎放线杆菌扩增出378 bp和442 bp的目的片段（见图3）。

3.4 PCR灵敏性检测

从稀释好的菌液中取1 mL用上述所建的检测方法进行检测，并测得原浓度（未稀释）菌液浓度为4.8×108个/mL，且第1轮PCR检出率为480个/mL（见图4）；第2轮PCR最低检出率为48个/mL（见图5）。

图3 参考菌株电泳鉴定结果

图4 标准菌株第1轮PCR产物电泳鉴定结果

3.5 PCR方法与经典病原学方法对病料的检测结果对比

对各养殖场送检的7份疑似传染性胸膜肺炎感染的病料分别采用细菌分离生化鉴定和PCR检测，结果均检测出其中2份病料为传染性胸膜肺炎放线杆菌阳性，其余均未检测到传染性胸膜肺炎放线杆菌（见图6、图7）。PCR检测法与细菌分离生化鉴定检测法的符合率为100%。

图5 标准菌株第2轮PCR产物电泳鉴定结果

图6 病料2电泳鉴定结果

图7 病料6和7电泳鉴定结果

4 讨论

建立的PCR检测方法在送检的7种病料中未检测出链球菌、巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌和大肠杆菌等病原，利用此检测方法能够检测到最低含量为48个/mL的细菌浓度。说明建立快速、灵敏、高通量的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR诊断方法，可以为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的检测提供一种确实有效的诊断方法。对采集的病料分离培养鉴定和病料提取DNA进行PCR扩增后二者结果符合率为100%。