基于LPS/TLR4通路研究疏肝理脾汤治疗NASH大鼠的作用机制*

王 雅 刘玉娟 代 静 张 涛△

1.湖南中医药大学第一附属医院 (湖南 长沙， 410007) 2.湖南中医药大学

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是指在非酒精性肝病(NAFLD)基础上，肝脏发生炎性细胞浸润的一种病理表现，是进展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌的必经步骤[1]。近年来，多项研究证实NAFLD患者肠道菌群失调导致增殖的脂多糖(LPS)激活Toll样受体(TLR4)信号通路，引发炎性/负炎性细胞因子严重失衡[2]，从而导致NASH发生及进展。本课题组基于中医“肝病实脾理论”，认为NASH病因病机均与“脾虚”相关，在前期以“健脾、益气、活血、利湿”为代表的“实脾理论”治疗NASH的临床研究中发现，其在改善中医症候、肝功能、血脂水平等方面具备优势[3、4]。以“疏肝健脾活血”立法的疏肝理脾汤源于疏肝健脾名方柴芍六君汤，在我院近40年的临床应用实践表明，其在改善肝脏炎症、纤维化方面疗效显著，是我院治疗慢性肝病经典复方。故本研究拟从LPS-TLR4信号通路角度出发，探讨基于“疏肝健脾活血法”立方的疏肝理脾汤治疗NASH的干预机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取健康、成年清洁级SD雄性大鼠100只，体质量(180 g±10 g)，由湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心提供，许可证号：SYXK(湘)2013-0005，饲养于湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心。

1.2 药物制备 疏肝理脾汤组成(成人剂量)：柴胡、茯苓、白芍各15 g、茜草、白茅根、地龙各10 g、湘曲、砂仁、鳖甲各5 g组成。所有中药由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。采用传统中药熬制方法煎制，经水浴浓缩至生药含量2.0 g/ml,4℃保存备用。蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)配方：L-氨基酸175.7 g/kg、玉蜀黍淀150 g/kg、右旋麦芽糖50.0 g/kg、纤维素30.0 g/kg、玉米油100.0 g/kg、碳酸氢钠7.4 g/kg、盐混合物35.0 g/kg、维生素混合物10.0 g/kg)。购自南通特洛菲饲料科技有限公司。

1.3 实验试剂 TLR4抗体(Abcam公司)，TLR引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)，HPR标记的羊抗兔二抗(Proteintech公司;型号：SA00001-2)，微量移液器(德国Eppendorf公司)，Tirol( 生工生物工程(上海)股份有限公司;型号B610409)，一步法反转录荧光定量试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司;型号B639277]，RIPA蛋白裂解液(CWBIO；CW2334S)，5X SDS-PAGE loading buffer(CWBIO，CW0027S)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(CWBIO，CW0014S)；彩色预染蛋白marker(Therm(Fermentas)，26616)；速泳SDS-PAGE电泳液(CWBIO，CW2566)，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(CWBIO，CW0022)；Western抗体稀释液(CWBIO，CW2340S)；PVDF膜0.45um(millipore，IPVH00010)；PVDF膜 0.22um(millipore，ISEQ00010)；BSA(roche，G5001)；TWEEN 20(Solarbio，T8220)；化学发光检测试剂盒(CWBIO，CW0049)；羊抗鼠二抗(PROTEINTECH，SA00001-1)；羊抗兔二抗(PROTEINTECH，SA00001-2)。

1.4 实验方法

1.4.1 造模阶段 适应性喂养1周后，随机选取10只大鼠进入对照组，给予正常饮食，剩余 90只入实验组，实验组给予MCD饮食，投食量每只为10 g/100 g体重，饮水量每天为12 ml/100 g体质量。各大鼠每周分别称重，按相应体重调整投食及饮水量，根据大鼠生长情况，每天称重调整摄食量及饮水的用量。在给予相应饲料后，每天观察动物进食、饮水、行为、活动、精神状态、毛发及大小便等情况。共饲养5周后，随机抽取6只大鼠进行肝脏病理切片检测，评判造模是否符合人类NASH 病情演变和病理特点。光学显微镜下观察造模组可见广泛弥漫性大泡性脂肪变性及肝细胞气球样变，腺泡内可见明显点、灶状坏死，散在可见淋巴细胞、炎性细胞浸润；正常组肝细胞形态规则,胞浆清透，大小一致，肝窦清晰，提示造模成功。

1.4.2 分组与给药 造模成功后，将84只大鼠按随机原则分为6组，每组14只，其中两组为无中药干预对照组，分别继续予以MCD饮食(MM组)和正常饮食(MN组)，给予等量蒸馏水灌服；两组为继续MCD 饮食加中药干预，中药干预分为中药低剂量(D低组)、高剂量(D高组)；两组为正常饮食加中药干预，分为中药低剂量(Z低组)、高剂量(Z高组)。另设对照组(N组)，为同批次非造模大鼠，不做药物处理。

参照陈奇主编《中药药理研究方法学》第2版(2006年人民卫生出版社)计算给药剂量，大鼠与成人的换算系数Rab为0.162，根据换算公式，换算出大鼠的给药量为3.09 g/kg(中剂量)。疏肝理脾汤低、高给药剂量比例为1∶4。使用蒸馏水将中药汤剂配成低浓度、高浓度分别为0.07 g/ml、0.31 g/ml备用。复方中药制剂，蒸馏水给予时间均为每日14∶30，持续4周,于实验9周末处死所有动物。

1.4.3 标本采集 予3.5%水合氯醛1 ml/100 g腹壁下麻醉注射，腹主动脉取血，分离血清。滤纸吸湿后，取0.3 g肝组织，放入玻璃杯中，加入0.9%氯化钠溶液，4℃，3500 r/min离心机离心10 min，匀浆提取上清液。

1.4.4 指标检测 疗程结束后，取腹主动脉血，罗氏全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。用ELISA法检测肿瘤坏死因子(TNF)-α。取门静脉血1 ml，离心后取血浆，按照鲎试剂盒说明说操作检测LPS。细胞炎症因子检测用ELISA 法检测血清中TNF-α、IL-6、IL-1含量。肝组织匀浆液予实时荧光定量PCR 法检测TLR4mRNA，各组大鼠按照TLR4试剂盒说明书进行相关RNA抽提，反转录成cDNA,TLR4上游引物GAGGCAGCTCTTGGTGGAAGTTG；下游引物CAAGCACACTGAGGACCGACAC，产物长度137bp。依次进行梯度PCR扩增,PCR产物电泳操作，凝胶成像系统观察。

Western Blot实验步骤：组织总蛋白提取：(1)组织块用冷PBS洗涤2～3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。(2)将匀浆液转移至1.5 ml离心管中，振荡,冰浴 30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。(3)12 000 g离心10 min，收集上清液，即为总蛋白溶液。蛋白浓度测定：BCA法测蛋白浓度；SDS-PAGE电泳。

1.5 SAF积分评判标准 大鼠肝组织病理学评分标准参考非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)关于肝组织活检采用欧洲脂肪肝协组织提出的肝脏炎症活动积分SAF积分(肝脂肪变+肝细胞损伤+炎症坏死)进行判断[1、5]。SAF计分=肝脂肪变+气球样变+小叶炎症；SAF<3分，排除NASH，SAF>4诊断NASH，介于两者间，伴有小叶炎症，气球样变诊断为NASH。

2 结果

实验结束后，N组大鼠无死亡，因麻醉意外，MN组死亡1只大鼠、Z高组、MM组分别死亡2只大鼠，因灌胃操作失误，MN组、MM组、D高组、D低组各死亡1只大鼠。

2.1 肝脏组织肉眼表现 N组大鼠肉眼见呈红褐色，边缘锐利，被膜光滑，触诊质地柔软，有弹性；MN组、MM组大鼠肉眼见呈黄褐色，体积较正常组稍大，表面可见散在白色斑点，触诊质地有油腻感；Z高组、Z低组、D高组、D低组肉眼见呈黄褐色，体积较正常组稍大，触诊质地稍柔软伴有油腻感，弹性较正常组稍减弱。

2.2 肝组织病理学表现 电镜下N组大鼠肝小叶及肝窦结构完整，肝索排列完整且清晰可见，无脂肪变及气球样变。MN、MM组大鼠肝小叶和肝窦结构欠完整，肝索排列紊乱，可见明显脂肪变，伴随大量气球样变，腺泡内可见大量点灶状坏死，门管区稍见星芒状纤维化；Z高组、Z低组、D高组、D低组可见轻、中度脂肪性变，可见散在气球样变，腺泡内可见散在点灶状坏死。

2.3 各组大鼠SAF积分表 见表1。

表1 各组大鼠SAF积分

与N组比较，*P<0.05;与MN组比较，#P<0.05；与MM组比较，☆P<0.05,△P<0.01；与Z高组比较，#P<0.05；与Z低组比较，&P<0.05。

2.4 各组大鼠血清学指标结果 见表2。

表2 各组大鼠血清生化指标比较

与N组比较，*P<0.05,与MN组比较，△P<0.05，与MM组比较，▲P<0.05; 与Z高组比较，

#P<0.05；与Z低组比较，&P<0.05, 与D高组比较，@P<0.05。

2.5 血清细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1检测结果 见表3。

表3 各组大鼠血清细胞炎症因子比较

与N组比较，*P<0.05；与MN组比较，△P<0.05；与MM组比较，☆P<0.05，与Z高组比较，#P<0.05；与Z低组比较，&P<0.05

2.6 血浆LPS水平比较结果 见表4。

表4 各组大鼠血浆LPS水平比较

与N组比较，*P<0.05;与MN组比较，△P<0.05；与MM组比较，

☆P<0.05,△P<0.01；与Z高组比较，#P<0.05；与Z低组比较，&P<0.05

2.7 实时荧光定量PCR法测肝组织 TLR4mRNA结果 见表5。

表5 各组大鼠肝组织TLR4mRNA表达比较

与N组比较，*P<0.05;与MN组比较，△P<0.05；与MM组比较，

☆P<0.05；与Z高组比较，#P<0.05；与Z低组比较，&P<0.05

2.8 Western Blot法测TLR4蛋白水平的表达灰度分析结果 见表6、图1。

表6 各组大鼠肝组织中TLR4蛋白靶基因/actin比值比较

与N组比较，*P<0.05;与MN组比较，△P<0.05；与MM组比较，☆P<0.05；与Z高组比较，#P<0.05；与Z低组比较，&P<0.05

图1 Western Blot法TLR4蛋白印迹图

3 讨论

中医理论对于NASH无特定病名，多依照“痞病”、“肥胖病”、“肝癖”、“肝痞“、“胁痛”等疾病论治，其病因病机复杂，早期多见脾气虚，继之肝郁气滞，脾虚益甚，日久肝脾肾俱虚，但无论是肝郁还是肾虚，都与脾密切相关[6]。“肝病实脾”理论源于《金匮要略》“夫治未病者，见肝之病，知肝传脾，当先实脾”，“实脾”已涵盖“疏肝、健脾、祛湿、化瘀”诸治法，故基于“肝病实脾”理论指导NASH临证论治是目前中医治疗NASH主要理论之一[7]。

以“疏肝健脾活血”立法的“疏肝理脾汤”是我院治疗慢性肝病经典复方，其源于疏肝健脾名方“柴芍六君汤”。该方由柴胡、茯苓、白芍、茜草、白茅根、地龙、湘曲、砂仁、鳖甲组成。方中柴胡疏肝行气为君，茯苓益气健脾，健胃消食为臣，白芍养血柔肝为佐，地龙、湘曲、砂仁、鳖甲滋阴潜阳，健脾消食为佐。在我院近40年的临床应用实践表明，对改善各类慢性肝病肝脏炎症、纤维化方面，尤其伴有腹胀、腹泻，大便不调等“脾虚”症状临床疗效显著。

TLR4隶属于表面模式识别受体(PRR),是存在于细胞膜的一种跨膜蛋白，通过识别特异性LPS的细胞膜受体，激活肝星状细胞、巨嗜细胞等，是NASH中关键的炎症信号通路[8～9]。研究证实内毒素越过肠道屏障进入肠壁组织、肠系膜淋巴结，通过门静脉进入肝脏，参与刺激TLR4蛋白表达，激活机体免疫介导的IL-4、IL-6炎症细胞因子增殖，从而导致肠源性内毒素血症形成，是NASH重要发病机制之一[10]。临床试验研究证实NASH 受试者肝组织中TLR4表达明显高于正常受试者表达，且与炎症程度和纤维化程度呈正相关；大量增殖的革兰阴性菌和LPS，与门静脉血浆内毒素水平呈正相关。上述研究说明内毒素聚集启动固有免疫反应，激活TLR4信号通路，引发炎性/负炎性因子严重失衡，诱导肝脏的炎症反应, 从而促进NAFLD进展为NASH[11]。故减少肠源性LPS血症，抑制肝脏组织TLR4信号表达，从而减轻脂肪肝相关炎性反应，已成为治疗NASH的新策略。

本研究以中医理论为指导，结合多年我院临床实践，予疏肝理脾汤治疗NASH大鼠，研究结果显示：从肝脏组织病理上，证实具有缩小肝细胞脂变范围，减轻炎性细胞浸润的作用；从生化学检测，发现具有显著降低其外周血ALT、AST、TC、TG、IL-1、IL-6及TNF-α水平的作用；以上结果说明疏肝理脾汤具有较强的降低血脂、保护肝细胞、减轻NASH炎症细胞增生反应作用。本研究同时对LPS/TLR4信号通路相关指标进行检测，结果显示疏肝理脾汤干预治疗后，可显著降低NASH大鼠血浆LPS水平、抑制肝脏组织TLR4信号表达；进一步分析以疏肝理脾汤高、低剂量、继续MCD饮食及正常饮食不同的四组，进行两两比较发现，疏肝理脾汤高剂量联合正常饮食组的以上述指标评价的疗效优于其余三组。

综合上述研究，“疏肝健脾汤”对NASH大鼠的干预机制可能与其影响LPS/TLR4信号通路，从而达到抑制相关炎症细胞因子分泌，减轻肝细胞炎性反应及脂肪变性的目的。本研究同时发现通过改变饮食，疗效得到显著提高，其机制有待下一步深入研究。