HPLC法测定妥布霉素滴眼液中5种抑菌剂

张冬梅，李玉杰，王松，张丹丹，于明艳

(山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101)

妥布霉素(Tobramycin，Tob)是第二代氨基糖苷类抗生素，临床主要用于眼部、呼吸道、中枢神经系统、尿道、胃肠道及软组织、骨等的细菌感染,对于由多重耐药性志贺氏菌引起的菌痢也有很好的疗效，优于阿米卡星(Amikaein)、庆大霉素等。妥布霉素滴眼液主要适用于敏感菌所致的外眼及附属器的局部感染[1]。

2018年，我院承担了妥布霉素滴眼液国家药品计划抽验评价任务，共抽取妥布霉素滴眼液174批次，涉及生产企业21家，涉及批准文号23个。抽验样品规格除1家企业外均为多剂量包装。多剂量包装滴眼液为多次使用制剂，为了防止开封后保存和使用过程中微生物的污染，因此在处方中会加入一定剂量一种或几种抑菌剂。临床数据表明，抑菌剂的加入对眼部均有不同程度的刺激性，使用过量还会对眼组织产生损害，如苯扎氯铵可导致眼部炎症、过敏、纤维化和干眼症；硫柳汞可引起明显的点状角膜上皮损伤、可使隐形眼镜变色[2-3]，眼药水中的防腐剂有细胞毒性作用[4]。因此抑菌剂加入的量应严格控制。妥布霉素滴眼液不同生产企业添加的抑菌剂种类及浓度不同，药典及相关单篇标准对抑菌剂的检查未涵盖所有企业处方中使用的抑菌剂类别，个别抑菌剂缺少相关检验标准，无法监督其投料情况[5-10]。我国药典标准仅控制苯扎氯铵、羟苯乙酯、羟苯丙酯3种抑菌剂，未涵盖企业实际使用的如硫柳汞钠、苯扎溴铵抑菌剂。本研究拟建立妥布霉素滴眼液中抑菌剂检查方法，涵盖所用的全部抑菌剂，为该品种的质量控制和安全监管提供参考。

1 仪器与试药

LC-20AT高效液相色谱仪(岛津)、CP225D电子天平。羟苯乙酯(99.9%，批号：100847-201604)、羟苯丙酯(99.6%，批号：100444-201403)、苯扎溴铵(10.9 mg·mL-1，批号：135051-201401)、苯扎氯铵(12.19 mg·mL-1，批号：1300549-201504)等对照品来自中国食品药品检定研究院；硫柳汞对照品(96.6%，Dr.Ehrenstorfer GmbH，批号：43172)。

妥布霉素滴眼液来自2018年国家评价性抽验样品，174批，来源于21家企业。辅料包括硼酸、硼砂、依地酸二钠、玻璃酸钠、氯化钠、硫代硫酸钠、聚维酮K30、羟丙甲纤维素、无水硫酸钠，来自2018年国家评价性抽验。乙腈、甲醇均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，柱温35 ℃，测定波长214 nm，进样体积20 μL，流速1.0 mL·min-1，流动相A为1%三乙胺(磷酸调节pH值至3.5±0.05)；流动相B为甲醇，梯度洗脱程序见表1。

2.2 溶液的制备和测定

2.2.1 对照品溶液 精密称取羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞钠和苯扎溴铵对照品适量，用甲醇依次溶解稀释制成每1 mL中含羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞钠和苯扎溴铵分别为0.04、0.04、0.1和0.2 mg的溶液，作为对照品溶液的混合溶液。另精密量取苯扎氯铵对照品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含0.2 mg的溶液，作为苯扎氯铵对照品溶液。

表1 梯度洗脱程序

2.2.2 供试品溶液 样品中含苯扎溴铵、苯扎氯铵和硫柳汞的滴眼液，直接取样品作为供试品溶液；含羟苯乙酯和羟苯丙酯的样品，取样品加甲醇定量稀释制成含羟苯乙酯和羟苯丙酯为40 μg·mL-1的溶液，作为供试品溶液。

2.2.3 系统使用性 按“2.1”项下的色谱条件，精密量取“2.2.1”项下各混合对照品溶液，进样20 μL，分别记录色谱图，系统适用性溶液中色谱图各成分的出峰顺序依次为羟苯乙酯、硫柳汞钠、羟苯丙酯和苯扎溴铵(苯扎氯铵)，见图1～2。各相邻峰之间的分离度均大于1.5。

1.羟苯乙酯；2.硫柳汞；3.羟苯丙酯；4.苯扎溴铵图1 系统适用性试验色谱图

1.n-C12H25；2.n-C14H29图2 苯扎氯铵系统适用性试验色谱图

精密量取混合对照品溶液、苯扎氯铵对照品溶液和样品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算各抑菌剂的含量。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验 按各企业处方工艺配制不含抑菌剂的阴性对照样品，在各抑菌剂的保留时间处均无色谱峰，阴性对照溶液无干扰。

2.3.2 线性关系、定量限与检出限 按“2.2.1”项下的对照品配制方法，分别加甲醇定量稀释制成系列浓度的溶液，精密量取适量进入液相，以对照品进样浓度(μg·mL-1)为横坐标，以对照品峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。对照品峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。取仪器信噪比10∶1时进样量为各成分的定量限，信噪比为3∶1时进样量为各成分的检出限。回归方程、线性范围、定量限及检出限见表2。

表2 线性关系和定量限验证结果

2.3.3 精密度和重复性 精密量取各对照品溶液20 μL，按规定的色谱条件，连续进样6次，计算各抑菌剂峰面积的相对标准偏差(RSD)。取妥布霉素滴眼液样品4批(标示抑菌剂为羟苯乙酯和羟苯丙酯，标示含量各为0.2 mg·mL-1；标示抑菌剂为硫柳汞钠，标示含量为0.1 mg·mL-1；标示抑菌剂为苯扎溴铵，标示含量为0.2 mg·mL-1；标示抑菌剂为苯扎氯铵，标示含量为0.1 mg·mL-1)，每批次样品分别平行制备6份，计算样品溶液中各抑菌剂的含量及RSD。精密度及重复性RSD结果均小于1.0%，结果良好。

2.3.4 稳定性试验 将混合对照品溶液和苯扎氯铵对照品溶液分别在室温放置，于0、2、4、6、8、10、12 h后，按照“2.1”项下条件分析。测得5种抑菌剂主峰面积RSD均小于2%，均无显著变化，表明溶液室温放置12 h稳定。

2.3.5 回收率试验 按所有厂家处方配制不含抑菌剂的阴性对照溶液，精密量取5 mL，置9个10 mL量瓶中，分别精密量取10倍浓度的混合对照品溶液0.8、1.0和1.2 mL各3份，加入上述量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取阴性对照溶液5 mL，置9个10 mL量瓶中，分别精密量取10倍浓度的苯扎氯铵对照品溶液0.8、1.0和1.2 mL各3份，加入上述量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；量取20 μL分别注入色谱柱，测定抑菌剂含量，并计算平均回收率及RSD值，结果见表3。

2.3.6 耐用性 取混合对照品和苯扎氯铵对照品溶液，分别考察不同品牌色谱柱、流速相对值变化±20%、柱温变化±5 ℃、流动相A pH值变化时对抑菌剂测定结果的影响程度，其结果表明各抑菌剂峰之间的分离度均符合要求。

2.4 样品测定结果 按照新拟定的抑菌剂检查方法对174批样品进行检测，结果见表4。结果，使用硫柳汞钠的两批次全部不合格，仅为标示量的40%左右，一批次苯扎溴铵不合格，提示需要结合抑菌剂的选择合理性进一步查找不合格产生的原因。

2.5 影响因素对抑菌剂的影响 在影响因素试验下，按拟订的妥布霉素滴眼液抑菌剂测定方法对抑菌剂含量进行测定。高温条件下，苯扎溴铵、苯扎氯铵稳定，羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞钠含量降低。高湿条件对羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞钠、苯扎氯铵、苯扎溴铵均没有影响。光照条件下，羟苯乙酯、羟苯丙酯、苯扎氯铵、苯扎溴铵不受光照的影响，硫柳汞钠呈下降趋势，光照5 d后，硫柳汞含量下降近半，影响产品的安全性。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 通过紫外吸收光谱测定的结果，5种抑菌剂的紫外最大吸收波长如下：羟苯乙酯和羟苯丙酯均为256 nm处有最大吸收，苯扎溴铵和苯扎氯铵在262 nm附近有最大吸收，硫柳汞均无最大吸收，仅有末端吸收。在214 nm处5种抑菌剂均有较大吸收，经考察，其检出限和定量限均能达到定性及定量的要求，综合考虑，最终选择检测波长为214 nm[11]。

3.2 流动相的选择 分别用1%三乙胺溶液(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇[12]，1%三乙胺溶液(磷酸调pH至5.0)-甲醇和1%三乙胺(磷酸调节pH值至3.5)-甲醇，经过比较，pH 5.0时硫柳汞峰和羟苯丙酯完全重合，pH 3.0时，硫柳汞峰出峰过快，因此选择1%三乙胺(磷酸调节pH值至3.5)-甲醇体系，各峰分离度较好。

表3 回收率试验结果(n=9)

表4 样品测定结果

3.3 色谱柱的选择 通过各品牌色谱柱比较，使用250 mm C18色谱柱时，出峰较慢，峰容易在梯度时出现，拖尾较严重，而选择150 mm C18色谱柱时，使用规定的色谱条件，各抑菌剂峰之间的分离度均符合要求，因此建议选择150 mm C18色谱柱。

3.4 苯扎溴铵和苯扎氯铵的确证 苯扎溴铵为单一纯品，而苯扎氯铵非纯品，是一系列同系物，中检院提供的国家药品标准物质中含两种取代同系物，n-C12H25同系物含量为65.49%，n-C14H29同系物含量为34.09%，计算时以二者之和计。苯扎溴铵峰与苯扎氯铵n-C12H25同系物在液相色谱条件下为同一重叠峰，因企业在加入抑菌剂时单独使用，因此在检测中单独配制对照品溶液可以解决该问题，并不影响抑菌剂的检测。

3.5 限度的制定 《中国药典》2015年版(二部)妥布霉素滴眼液质量标准中羟苯乙酯、羟苯丙酯及苯扎氯铵限度为80.0%～120.0%，《美国药典》41版通则<341>要求，在生产时要保证药品中应含有标签中所标示的抑菌剂用量(生产和分析的允许偏差为±20%)，因此暂将方法限度设定为标示量的80.0%～120.0%。

4 结论

《中国药典》2015年版(二部)妥布霉素滴眼液质量标准仅控制羟苯乙酯、羟苯丙酯及苯扎氯铵，标准中缺少苯扎溴铵和硫柳汞的检测方法，对使用苯扎溴铵和硫柳汞作为抑菌剂的产

品，无法有效的控制其抑菌剂的含量，致使部分企业按制定的方法检验，含量未达到要求。本方法采用HPLC梯度洗脱程序，建立了可以同时测定盐酸妥布霉素中多种抑菌剂(羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴铵和苯扎氯铵)含量的方法，同时对方法进行了验证。该方法能有效地检测目前妥布霉素滴眼液中所用到的抑菌剂的含量，为滴眼液中抑菌剂的合理使用和质量控制提供了依据。使用该方法测定了174批妥布霉素滴眼液中抑菌剂的含量，发现部分企业产品抑菌剂的量低于标示量，影响到产品的有效性和安全性。从影响因素试验结果来看硫柳汞钠对光照十分敏感，建议包材选用避光滴眼液瓶。