高效液相色谱法测定鲑鱼降钙素鼻喷剂中苯扎氯铵的含量

周朝东，黄哲甦

(天津市药品检验研究院，天津 300070)

鲑鱼降钙素鼻喷剂适用于治疗骨质疏松症、由于骨质溶解或骨质减少引起的骨痛以及高血钙症等。经查阅，《中国药典》2015年版、《美国药典》41版、《欧洲药典》9.0版、《英国药典》2018年版及日本药局方17版中均未收载鲑鱼降钙素鼻喷剂。搜索国家药品监督管理局网站，目前国内有2家企业有鲑鱼降钙素鼻喷剂批准文号，分别是银谷制药有限公司和深圳大佛药业股份有限公司。国外只有Novartis(诺华)制药有限公司有批准文号。由于鼻喷剂为多剂量喷雾剂，故按照《中国药典》2015年版四部通则0106和0112的要求，除非制剂本身有足够的抑菌性能，否则应添加适宜浓度的抑菌剂。苯扎氯铵又名洁儿灭，是具有杀菌作用的季铵盐类阳离子表面活性剂，是氯化二甲基苄基烃铵的混合物，其杀菌特性源于季铵离子和烷烃链。季铵离子在水中带正电荷，可以吸附于带负电荷的微生物表面形成微团，并逐步渗入细胞浆的类脂层，从而改变细胞膜的通透性，使细胞内容物外渗，阻碍其代谢，从而起到杀灭微生物的作用[1]。目前，苯扎氯铵作为抑菌剂被广泛应用于各类制剂中，因此有必要对其含量进行准确测定。本文建立了鲑鱼降钙素鼻喷剂中苯扎氯铵含量测定的高效液相色谱法，以苯扎氯铵n-C10H21、n-C12H25、n-C14H29和n-C16H33取代同系物峰面积之和计算含量，方法简单快速，结果准确，可以应用于鲑鱼降钙素鼻喷剂中苯扎氯铵的含量测定。

1 仪器与试药

1.1仪器 岛津LC-20A型高效液相色谱仪，SPD-20A紫外检测器，LCsolution色谱工作站(日本岛津公司)； METTLER XS205型十万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2试药 苯扎氯铵含量测定用对照品由LGC生产，批号82370，纯度91.6%；鲑鱼降钙素对照品由企业提供，批号为H6091；3批鲑鱼降钙素鼻喷剂为本科室留样,由瑞士诺华制药企业生产,批号分别为H5096A，H5098和H5095A；五水合四甲基氢氧化铵购自sigma公司，批号为MKBX6732V。其余试剂均为分析纯,水为纯化水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：waters μBondpak®CN 125Å色谱柱(150 mm×3.9 mm，10 μm)；流动相：乙腈-水-四甲基氢氧化铵(475 ml∶525 ml∶1.99 g，磷酸调节pH值至2.5)；流速：0.6 ml/min；柱温：40 ℃；进样体积：50 μl；紫外检测器，检测波长：210 nm。由LCsolution软件计算得知，C10-苯扎氯铵与C12-苯扎氯铵峰之间的分离度为2.2，C12-苯扎氯铵与C14-苯扎氯铵峰之间的分离度为3.0，C14-苯扎氯铵与C16-苯扎氯铵峰之间的分离度为4.1，符合《中国药典》要求(大于1.5)。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取苯扎氯铵对照品约100 mg置100 ml量瓶中，用稀释液(取氯化钠0.850 g，加水使溶解成100 ml，用0.1 mol/L盐酸溶液调节pH值至3.7，即得)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为苯扎氯铵对照品贮备液。精密量取5 ml置50 ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，即得，此时苯扎氯铵对照品浓度约为0.1 mg/ml，平行制备2份对照品。

2.2.2供试品溶液的制备 取供试品溶液直接进样分析。

2.2.3阴性对照溶液的制备 按鲑鱼降钙素鼻喷剂的处方称取除苯扎氯铵外的成分配制成溶液，然后进样分析。

2.3专属性试验 取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各50 μl ，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，见图1。由图1可知，阴性对照溶液在苯扎氯铵出峰处均没有干扰峰出现，因此，鼻喷剂中其他成分、稀释液以及流动相对苯扎氯铵的含量测定均没有干扰。

2.4线性关系考查 精密称取苯扎氯铵对照品约50 mg置50 ml量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液贮备液；分别精密量取2.5、4、5、6和7.5 ml置50 ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，即得，其浓度范围从45.525 2～136.575 6 μg/ml，相当于供试品溶液标示浓度的约50%～150%。按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，以苯扎氯铵浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归。结果，回归方程为：Y=38 299 906X-18 967 467(r=1.000 0)，苯扎氯铵浓度在45.525 2～136.575 6 μg/ml内，其浓度与峰面积呈良好线性关系。

1.C10-苯扎氯铵 2.C12-苯扎氯铵

2.5精密度试验 取“2.2.1”项下苯扎氯铵对照品溶液按“2.1”项下色谱条件连续进样6次。结果，峰面积的RSD为0.17%，表明仪器精密性良好。

2.6重复性试验 取批号为H5096A的供试品5份，按“2.1”项下色谱条件测定分析，结果5份供试品的苯扎氯铵含量平均值为0.092 mg/ml，RSD为0.06%，表明供试品的重复性良好。

2.7稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液1份，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8和24 h各进样2针。结果，供试品溶液中的苯扎氯铵在24 h内峰面积的RSD为0.12%，表明苯扎氯铵溶液在24 h内稳定性良好。

2.8回收率试验 按鲑鱼降钙素鼻喷剂处方精密称取鲑鱼降钙素对照品和氯化钠适量置50 ml量瓶中，平行制作9份。然后分别精密量取“2.2.1”项下苯扎氯铵对照品贮备液4、5和6 ml置上述50 ml量瓶中，用盐酸溶液(pH 3.7)溶解并稀释至刻度，制成每1 ml含苯扎氯铵0.08、0.1和0.12 mg的溶液，每个加样浓度平行做3份，共9份，按“2.1”项下色谱条件进样分析。结果，9份样品的平均回收率为99.4%，RSD为0.69%。见表1。

表1 回收率测定结果(n=9)

2.9检出限和定量限试验 取“2.2.1”项下苯扎氯铵对照品溶液进行稀释，并按照“2.1”项下色谱条件进样分析，以信噪比S/N=3作为最低检出限，以信噪比S/N=10作为定量限。结果，最低检出浓度为8.19 ng/ml，检出限为0.4 ng；最低定量浓度为27.3 ng/ml，定量限为1.4 ng。

2.10苯扎氯铵含量计算公式 苯扎氯铵(mg/ml)=C对×

2.11供试品中苯扎氯铵测定结果 取3批供试品按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰峰面积，然后按照“2.9”项下计算公式进行计算，结果见表2。

表2 供试品中苯扎氯铵测定结果

3 讨论

苯扎氯铵由于其神经毒副作用小、抑菌作用强，被广泛地添加至消毒剂、健康护理液、化妆品、滴眼液和滴鼻液中[2]。苯扎氯铵原料及其溶液在《中国药典》2015年版[3]、《美国药典》41版[4]、《欧洲药典》9.0版[5]和《英国药典》2018年版[6]均有收载。 《中国药典》2015年版二部收载的苯扎氯铵原料仅规定本品为氯化二甲基苄基烃铵的混合物，按无水物计算，含烃铵基应为95.0%～105.0%，未对苯扎氯铵各取代同系物组成及其比例作出规定。《美国药典》41版、《欧洲药典》9.0版和《英国药典》2018年版则对苯扎氯铵各取代同系物组成及其比例作出规定且限度要求均为C12同系物不低于40%，C14同系物不低于20%，二者之和不低于70%。《美国药典》41版、《欧洲药典》9.0版和《英国药典》2018年版在苯扎氯铵各取代同系物组成测定方法上大致相同，略有差异。相同之处为：①均采用高效液相色谱法，配合紫外检测器，检测波长均为254 nm；②色谱柱均为氰基键合硅胶色谱柱，流速均为2 ml/min；③流动相均为乙腈-0.1 mol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.0)；④对照品和供试品的浓度均为4 mg/ml。不同之处主要有3点：①进样量不同，《美国药典》41版进样量为20 μl，《欧洲药典》9.0版和《英国药典》2018年版进样量则是10 μl。②系统适用性要求不同，《美国药典》41版要求C12同系物与C14同系物之间的分离度应不小于1.5，此外还要求C12同系物峰面积的相对标准偏差不低于2.0%。而《欧洲药典》9.0版和《英国药典》2018年版则只规定了C12同系物与C14同系物之间的分离度不小于1.5。③《美国药典》41版还提供了C10同系物的相对保留时间(相对C12同系物为0.9)和平均分子量(312)，而《欧洲药典》9.0版和《英国药典》2018年版只提了C12、C14和C16同系物的分子量，未提及C10同系物。

对于含量测定，《中国药典》2015年版、《美国药典》41版、《欧洲药典》9.0版和《英国药典》2018年版均采用滴定法，先精密加入碘化钾溶液与苯扎氯铵反应，再用碘酸钾滴定液滴定剩余的碘化钾溶液，结果用空白试验校正。《中国药典》2015年版与国外药典有三处异同：一是限度不同，《中国药典》2015年版规定限度为以无水物计算，含烃铵基应为95.0%～105.0%。《美国药典》41版规定限度为按无水物计算，应为97.0%～103.0%，《欧洲药典》9.0版和《英国药典》2018年版限度则为按无水物计算，应为95.0%～104.0%；二是萃取剂不同，《中国药典》2015年版采用三氯甲烷作为萃取剂，而《美国药典》41版、《欧洲药典》9.0版和《英国药典》2018年版则采用二氯甲烷作为萃取剂；三是滴定度的表述不同， 《中国药典》2015年版规定每1 ml碘酸钾滴定液(0.05 mol/L)相当于35.40 mg的C22H40ClN。而《美国药典》41版、《欧洲药典》9.0版和《英国药典》2018年版则规定每1 ml碘酸钾滴定液(0.05 mol/L)相当于X/10 mg的苯扎氯铵，X是平均相对分子量。

由于不同厂家生产的苯扎氯铵同系物组成不同，而苯扎氯铵不同取代同系物的抑菌谱又有差异[7]，因此，有必要对苯扎氯铵的同系物组成及其比例进行质量控制，而本文建立的高效液相色谱法操作简单快速，方法准确，可以应用于鲑鱼降钙素鼻喷剂中防腐剂苯扎氯铵的含量测定。