中药川楝子炮制前后总三萜的含量变化研究

崔乃华，夏林波，唐爽，段新新，邓仕任

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

川楝子(MeliatoosendanSieb.)，又名金铃子，为楝科植物楝(MeliatoosendanSieb.et Zucc.)的干燥成熟果实[1]，具有疏肝泻热、杀虫[2]、止痛[3]的功效。《中国药典》2015年版收录了川楝子生品和炒品[4]。川楝子生品有小毒，现代药理研究表明其具有肌无力、抑制呼吸中枢等毒副作用[5]，故常将其炮制后入药[6]，以达到“减毒增效”作用[7-8]。川楝素是目前公认的川楝子中的特征毒性成分，当前的炮制减毒研究多从川楝素的含量变化着手，而尚未见炮制对三萜类成分的整体含量变化的相关研究[9-12]。现已知，药的药效是多种成分共同作用实现的[13]，仅以川楝素这一种三萜成分含量变化作为其炮制机制的研究指标，显然是不全面、不充分的。本试验对川楝子炮制前后的总三萜含量变化进行研究，以期对为川楝子的炮制减毒机制进行较为全面的评价。

1 试验材料

1.1 试验药品 川楝子饮片购于河北省安国市中药材市场，经辽宁中医药大学鉴定教研室王荣祥教授鉴定为楝科植物川楝(MeliatoosendanSieb.et Zucc.)的干燥成熟果实。川楝素对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：130320)。甲醇、高氯酸、冰乙酸、香草醛均为分析纯。

1.2 试验仪器 FA1004B型精密电子天平(上海精密科学仪表有限公司)； DFT-100型高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；ZDHW型电热套(北京市永光明医疗仪器厂)。UV-1240型紫外可见分光光度计(日本岛津)；HH-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；DHG202-0型电热恒温干燥箱。

2 试验方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取川楝素对照品10 mg，精密加入10 mL甲醇溶剂，制成1 mg·mL-1的川楝素对照品溶液备用。

2.2 供试品溶液制备 精密称定本品粉末0.5 g于圆底烧瓶中，再精密加入甲醇25 mL，涡旋混匀后称定重量，加热回流1 h，冷却至室温后称定重量，用甲醇溶剂补足损失的重量，摇匀，抽滤，即得。

2.3 川楝子炮制品制备 严格按照《中国药典》2015年版中，炒川楝子项下的炮制方法进行。平行炒制3份，分别命名为炮制品1、炮制品2、炮制品3。

2.4 测定波长及显色条件 精密吸取50 μL川楝素对照品甲醇溶液置于具塞试管中，水浴蒸干甲醇溶剂，精密加入0.8 mL高氯酸稳定剂和0.2 mL 5%香草醛-冰乙酸显色剂，在60 ℃水浴中加热15 min后，立即移入冰水浴，精密加入5 mL冰乙酸摇匀后置于室温。取相应的空白试剂校正基线后，于200～600 nm波长范围内进行全波长扫描，在515 nm处显示最大吸收峰，所以样品的测定波长选择515 nm。

2.5 线性关系考察 分别精密量取5份川楝素对照品溶液20、40、60、80、100 μL，按“2.4”项下显色方法进行显色后，以空白试剂校正基线，在波长515 nm下分别测定吸光度，以吸光度Y对绝对量X(μg)绘制标准曲线，回归方程为Y=0.006 4X-0.001 2，R2=0.999 8；表明川楝素在20～100 μg范围内与吸光度具有良好的线性关系。

2.6 精密度试验 精密取川楝子生品供试品溶液300 μL，按“2.4”项下显色方法进行显色后，在上述条件下连续测定6次，分别记录吸光度值，吸光度平均值为0.353 0，RSD为1.64%，表明本法精密度良好，结果见表1。

表1 精密度试验结果

2.7 重复性试验 分别精密量取川楝子生品粉末6份，每份0.5 g,按“2.2”项下的方法分别制备供试品溶液，按“2.4”项下显色方法进行显色后，分别测定吸光度，计算总三萜含量平均值为9.223 mg·g-1，RSD为0.54%，表明此法重复性良好，结果见表2。

表2 重复性试验结果

2.8 稳定性试验 取川楝子生品供试品溶液300 μL，按“2.4”项下显色方法进行显色后，置于室温，分别在0、2、4、8、12、24 h测定各自吸光度，平均吸光度为0.358 0，RSD为1.87%，数据表明此供试品溶液在24 h内具有较好的稳定性，结果见表3。

2.9 加样回收率试验 取已知含量的川楝子生品(9.223 mg·g-1)9份，每份大约0.25 g，精密称定。置具塞锥形瓶中，每组精密加入低、中、高浓度的川楝素对照品溶液，按“2.2”项下的方法以制备供试品溶液，在上述显色条件下分析测定，结果表明该平均加样回收率为99.8%，RSD=0.94%(n=9)，结果见表4。

表3 稳定性试验结果

表4 加样回收率试验结果

2.10 样品含量测定 分别称取生品和不同炮制品粉末各约0.5 g，分别按“2.2”项下的方法制备供试品溶液后，在上述显色条件下分析，计算每个样品中总三萜的含量，结果如表5所示。

表5 川楝子各样品总三萜含量

3 讨论与总结

3.1 川楝子主产于我国南方各地，以四川省质量最佳，为四川省道地药材[14]。川楝子中主要活性成分川楝素具有驱虫、抗肉毒作用，明代之后对川楝子的毒性均认为有小毒[15]，是传统的理气中药，关于川楝子的炮制方法，最早可追溯到南北朝时期的《雷公炮炙论》[16]所记述的酒蒸法，并提出“使肉既不使核，使核既不使肉”。宋至清代是川楝子炮制发展的鼎盛时期，发展了炒制、醋煮、酒浸、童子便浸、盐炙、等炮制方法，近代在又新增了砂烫、烘制等方法，现行《中国药典》2015年版收录的是清炒法,川楝子经炮制后镇痛作用增强显著[17]，多炮制后使用，现代临床上主要用来治疗心痛、胸腹肋痛等。

3.2 总三萜的含量测定多采取显色法来进行。在显色过程中，文献中大多采用熊果酸[18]作为对照品。本试验发现，当采用熊果酸时，对照品显色后的最大吸收波长位于545 nm，而川楝子样品的最大吸收波长位于514～517 nm之间，上述结果表明熊果酸不适用于川楝子药材的总三萜含量测定，其原因可能在于川楝子中的三萜成分多为呋喃三萜类化合物，其结构与熊果酸差异较大，因此显色波长不同。基于上述考虑，我们尝试将对照品改为同为呋喃三萜结构的川楝素后，发现对照品最大吸收波长蓝移至515 nm，与实际样品吻合度较好，故最终采用川楝素作为对照品。

3.3 本文首次报道川楝子中总三萜含量测定方法以及川楝子生品和炮制品中总三萜含量变化。采用UV法[19]测定川楝子总三萜含量对精密度要求很高，试验操作过程要保证取样量以及显色剂的加入量必须精密准确，否则试验结果重复性较差。通过方法学考察表明，本方法线性关系良好，重复性和稳定性较好，可用于川楝子总三萜含量测定。