代谢重编程对巨噬细胞的可塑性和功能的影响

杨雪，杨勇

(中国药科大学药物科学研究院，江苏 南京 211100)

细胞代谢重编程的概念最早起源于癌细胞中的Warburg效应。在有氧气的条件下，线粒体呼吸作用被抑制，糖酵解途径增加并且乳酸产生增加的代谢方式最早由诺贝尔奖得主Otto Warburg发现，所以被称为“Warburg效应”或“沃伯格新陈代谢”[1]。糖酵解途径首先将葡萄糖代谢为丙酮酸，丙酮酸在线粒体中进一步代谢为二氧化碳、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)。还原当量(NADH和FADH2)驱动氧化磷酸化(OXPHOS)以获得更多的ATP合成。而Warburg效应发现，即使在有氧条件下，癌组织也利用比正常组织十倍以上的葡萄糖来产生乳酸。细胞内的乳酸分泌增加了NAD+的产生促使葡萄糖连续摄入细胞并且由此产生的糖酵解中间体的积累促进了细胞的生物物质的快速合成。自从Warburg效应被发现和定义以来，这种效应一直被认为仅在癌细胞中发生。像Warburg效应这种，细胞脱离了正常的代谢通路，产生异常量的代谢中间体和代谢物甚至产生新的代谢产物，这种细胞过程即为代谢重编程。然而，最近的研究结果表明，类似Warburg效应的代谢重编程也存在于快速增殖的其他细胞中，包括各种类型的免疫细胞，最明显的是在巨噬细胞和T细胞中，并决定免疫细胞亚群在例如炎症性疾病和癌症等疾病状况中的功能。

巨噬细胞是机体内固有免疫晚期应答的主要效应细胞，同时，在适应性免疫的抗原提呈中也发挥着作用。巨噬细胞来源于骨髓干细胞，以单核细胞为前体，后在定居组织中发育为成熟巨噬细胞。成熟巨噬细胞在生物学特征方面具有极大的可塑性，不同微环境可激活其分化为不同功能亚群，成为活化巨噬细胞。巨噬细胞显示一系列功能激活表型，具体取决于它们所处的微环境的组成，包括组织/器官的类型和性质以及具体的生理病理条件。在不同巨噬细胞活化表型中，其上述过程也不尽相同。最近的研究表明促炎性巨噬细胞激活与代谢重编程特别是有氧糖酵解密切相关，三羧酸循环(TCA循环)发生改变，并且线粒体呼吸减少。我们对巨噬细胞的可塑性如何受局部微环境调控的认识还很有限。所以，本文主要综述了细胞的代谢途径对于巨噬细胞感知微环境和改变其功能的相关作用以及这个过程所涉及的疾病和以后将进行的治疗方向。

1 巨噬细胞通过代谢适应感知微环境

巨噬细胞在人体几乎所有组织中都大量存在，在监视和调节局部组织微环境中发挥重要作用[2]。局部组织微环境的组成(例如代谢物，细胞因子、氧张力、炎症信号)和来自其他组织细胞的信号对巨噬细胞代谢和功能的可塑性起决定性作用[3]。反过来，细胞的新陈代谢可能直接通过产生和消耗代谢物来影响微环境[4]。由此可见，响应于局部环境中不断变化的代谢条件，组织巨噬细胞的功能表型可能也在持续不断的变化当中。组织巨噬细胞的这种功能可塑性反映在无数的转录改变和代谢表型变化上[5]。例如，没有炎症刺激期间，组织巨噬细胞会表现出相应的功能表型，促进和维持体内平衡，而如果有炎症刺激条件下，巨噬细胞则会监测微环境的改变并从转录和代谢的基线水平向能够适应体内炎症环境的方向转变，一旦炎症刺激被清除，其又能立即返回基线水平。可见，巨噬细胞内的转录和代谢变化是可诱导、可逆的[6-7]，巨噬细胞的功能与细胞代谢的改变密切相关，巨噬细胞的可塑性与巨噬细胞改变或重新编程细胞代谢的能力直接相关。

2 M1巨噬细胞活化产生的代谢适应

ATP的产生为巨噬细胞功能提供了能量。葡萄糖是最主要的ATP产生来源，产生过程主要包括两个途径，上游途径是胞浆中的葡萄糖代谢为丙酮酸，丙酮酸继而在线粒体中生成乙酰辅酶A(乙酰CoA)。下游途径是乙酰CoA接着进入TCA循环，最终被氧化生成H2O和CO2，过程中产生还原当量的NADH和FADH2，经OXPHOS中的电子传递链传递，以氧作为电子受体来支持ATP合成酶催化产生ATP(净产生36个ATP分子)。TCA循环与氧化磷酸化以及线粒体的功能紧密相关。当糖酵解减少时，细胞也可以代谢谷氨酰胺或脂肪酸来补充TCA循环并维持氧化磷酸化。当氧气变得有限或三羧酸循环中断时，细胞进行无氧糖酵解，丙酮酸转化为乳酸而不是乙酰CoA。尽管糖酵解产生较少的ATP分子，但其产生速度更快，对维持能源水平具有潜在的重要性。在稳态条件下巨噬细胞表现出的代谢特征与正常氧气充足的条件下一致，而在体外，M1巨噬细胞(用LPS刺激或IFNγ和LPS共同刺激所激活)中，三羧酸循环的利用降低，OXPHOS减少，并且葡萄糖向乳酸的代谢即糖酵解增加，呼吸链的活动被削弱的同时，活性氧物质(ROS)的产生也随之增加[4,7-8]。重要的是，这种代谢适应并不是因为缺氧而发生，因此被称为“有氧糖酵解”[5,9]。线粒体氧化磷酸化的减少与线粒体三羧酸循环中间体的积累有关，例如柠檬酸盐，琥珀酸盐和延胡索酸盐，也与增加的谷氨酰胺和精氨酸的消耗有关[10-11]。

3 M2巨噬细胞活化产生的代谢适应

与M1巨噬细胞相反，IL-4激活的巨噬细胞(M2巨噬细胞)更依赖于从脂肪酸的氧化和谷氨酰胺的消耗中获取持久的能量。M2巨噬细胞可促进电子传递链中的组分表达，并且驱动丙酮酸进入三羧酸循环，所以在活化的M2巨噬细胞中观察到的是有OXPHOS过程而没有有氧糖酵解的代谢表型[3,12]。某些慢性涉及IL-4信号传导的疾病(例如寄生虫感染、变态反应、哮喘)可能与M2巨噬细胞持续维持OXPHOS状态有关，而另一方面慢性炎症刺激可能与抑制巨噬细胞的有氧糖酵解有关[13]。在正常的稳态条件下或应激条件下，特别是在体内，M2巨噬细胞的代谢表型仍不清楚。此外，是否可以利用代谢的重新编程来干扰M2巨噬细胞的功能也有待未来的研究。因此，本文之后的综述主要聚焦的主体是炎性巨噬细胞即M1巨噬细胞。

4 参与巨噬细胞代谢适应的关键物质

在LPS或IFN-γ激活的巨噬细胞中TCA循环的代谢重编程涉及两个重要酶的下调，导致TCA循环功能上的中断[14]。第一次中断涉及异柠檬酸脱氢酶(IDH)表达显著降低，导致柠檬酸盐的生成大量增加[15]。柠檬酸盐可从TCA循环中产生并运输进入细胞质中并发挥至少3个重要作用：①产生具有抗微生物及抗炎特性的衣康酸[16]；②产生能合成新型膜脂，花生四烯酸和前列腺素的脂肪酸[17]；③产生草酰乙酸，继而产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)[17]。TCA循环中第二次中断发生在琥珀酸转化为延胡索酸的过程中，是由于琥珀酸脱氢酶(SDH)的抑制[15]。SDH的抑制不仅导致琥珀酸盐水平增加，也导致线粒体呼吸减少(因为SDH构成线粒体呼吸链复合体Ⅱ)[17]。线粒体琥珀酸转运蛋白表达增加，将积累的琥珀酸盐转运进入胞质中，在胞质中，琥珀酸盐抑制脯氨酸羟化酶(PHD)降解，PHD是促进HIF1降解的物质，因此PHD抑制的功能性后果是导致HIF1蛋白的稳定和积累[4]。累积的HIF1蛋白直接促进促炎性细胞因子IL-1β的转录并正向调节糖酵解途径中关键酶(例如己糖激酶1)和转运蛋白(例如葡萄糖转运蛋白1，GLUT1)的表达[4]。在线粒体中，累积的琥珀酸盐可以抑制线粒体呼吸链复合体Ⅰ，导致ROS产生增加，ROS也可以抑制胞质中的PHD[18]，这进一步稳定了HIF-1，ROS介导的PHD抑制也促进NF-κB信号传导[19]。

最近的一项研究表明，琥珀酸盐的线粒体积累不止发生于M1巨噬细胞中。在小鼠肾脏，心脏和大脑局部缺血和再灌注损伤的模型中，琥珀酸积累是一种普遍的缺血的代谢特征[20]。然而，与M1巨噬细胞中SDH的抑制相反，作者发现在缺血期间SDH不是抑制，而是反向催化并减少延胡索酸盐向琥珀酸盐的累积[20]。 SDH的这种反向催化的原因是由于在缺血性条件下胡索酸盐过多的积累。作者证明再灌注时，琥珀酸盐很快被SDH重新氧化，通过在线粒体复合体Ⅰ上的反向电子转运机制驱动广泛的ROS生成[20]。有趣的是，癌细胞代谢也与增加某些TCA循环中间体有关，如琥珀酸盐[21]。这导致一种假设的提出，即在线粒体琥珀酸盐积累和有充足氧气的存在下，ROS都会在复合物Ⅰ中显著增加。由于ROS是公认的重要的促炎性物质[22]，则M1巨噬细胞中TCA循环中断可能促进炎症信号的传导。

在IDH和SDH被抑制之前，有琥珀酸盐和柠檬酸盐的前体进入TCA循环，这个补充的TCA循环周期被称为回补反应。最近有人提出在M1巨噬细胞中天冬氨酸-精氨琥珀酸循环的活性增加和天冬氨酸-苹果酸循环穿梭的修饰这两条线路的代谢调整，都导致中间体延胡索酸盐和苹果酸盐的补充[15]。这两条代谢调整的线路在TCA循环中断的M1巨噬细胞中还具有其他几个方面潜在的功能：①增加的琥珀酸盐可以进一步抑制SDH活性并加强琥珀酸盐积累或促进SDH的反向催化[20]；②苹果酸在苹果酸-天冬氨酸穿梭中起重要作用，能够在胞质中再生NAD+，被用于糖酵解过程并促进线粒体内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)合成以用于生成ATP。然而，在M1巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达增加导致高瓜氨酸水平上升[23]，天冬氨酸可以与瓜氨酸反应生成精氨琥珀酸盐，精氨琥珀酸盐进一步代谢为精氨酸(iNOS的底物，有利于平衡精氨酸-琥珀酸和瓜氨酸-精氨酸之间的循环)和琥珀酸盐来补充TCA循环。

那么，在M1巨噬细胞中精氨琥珀酸途径活跃所带来的功能性影响是什么呢？精氨琥珀酸途径与瓜氨酸-精氨酸循环相互作用来再生精氨酸，使iNOS持续产生NO。有研究表明在巨噬细胞中维持NO产生的这种代谢适应可以杀死细胞内的分枝杆菌[24]。此外，IL-1β也被证明在巨噬细胞分枝杆菌的感染控制中至关重要[25]。另一方面，iNOS的持续活跃和NO的产生对于抑制炎性小体产生IL-1β也很关键[26]。因此，巨噬细胞环境依赖性功能的微调可以通过调节精氨琥珀酸途径的活性和精氨酸的利用来完成。

NO还导致线粒体呼吸链复合体Ⅱ的抑制(即SDH)[27]，再次强化了TCA循环的上述中断。瓜氨酸-精氨酸循环的重要作用也进一步体现，有报道表明在表达iNOS并Toll样受体(TLR)激活的血单核细胞来源的树突状细胞(DCs)中，线粒体功能障碍与iNOS的表达和有氧糖酵解的代谢重编程只同时发生在能产生NO的DCs中[28]。在巨噬细胞中也有类似的报道，NO促进糖酵解代谢过程[28-29]。NO也会通过抑制呼吸链促进电子泄漏来增加ROS的产生，进一步促进PHD抑制，导致HIF1更加稳定并促进细胞因子产生[27-28]。

再生精氨酸也可以被精氨酸酶1用于促进鸟氨酸合成谷氨酸盐，它可以补充到中断的TCA循环中。有报道称在LPS激活的巨噬细胞中，谷氨酰胺通过γ-氨基丁酸(GABA)途径的代谢主要参与TCA 循环的回补反应[5]，但是GABA途径所需的酶是否在巨噬细胞中表达这点并不明确[15]。因此，TCA循环的回补反应可能发生在精氨酸酶将精氨酸转化为鸟氨酸产生谷氨酸的代谢过程中。考虑到在巨噬细胞中的尿素循环中鸟氨酸无法代谢(由于缺乏鸟氨酸氨甲酰基转移酶的表达[23])，鸟氨酸通过精氨酸酶代谢为谷氨酸成为了另一个参与TCA 循环回补反应的代谢通路[15]。通过瓜氨酸和天冬氨酸反应再生精氨酸，M1巨噬细胞逐渐成为精氨酸自养型，这种代谢适应对于维持精氨酸浓度很快会受到限制的M1巨噬细胞的功能尤其重要[23]。另外，在肉芽肿反应中(M2巨噬细胞激活，精氨酸酶1高表达)T细胞增殖可能不仅与精氨酸有关[4]，还与M2巨噬细胞中代谢编程的调节有关。

由于M1巨噬细胞处于LPS和IFN-γ激活的强烈炎症环境中，iNOS，精氨琥珀酸合成酶(ASS)和精氨琥珀酸裂解酶(ASL)(精氨琥珀酸循环中的关键酶)都高表达[18]，并且精氨酸酶1是HIF-1的调控基因[5]，这些数据都支持了这么一个假说：M1巨噬细胞中的代谢适应总是朝着协调表达HIF1，精氨酸酶1，苹果酸-天冬氨酸，精氨琥珀酸和瓜氨酸-精氨酸途径的方向进行，并有利于维持TCA循环的回补反应。但是，SDH，IDH抑制和精氨琥珀酸循环增加的代谢重编程现象是否为巨噬细胞在各种炎症状况中的普遍代谢适应还不清楚，这种代谢重编程现象是否发生在相对轻度炎症和慢性炎症状况中也有待进一步的研究。

5 巨噬细胞代谢适应带来的功能变化

为什么M1巨噬细胞的代谢方式转变为有氧糖酵解并且线粒体呼吸减少？肿瘤细胞的代谢适应被认为主要是由体细胞突变驱动，而炎症细胞中代谢适应的发生独立于体细胞突变。因此，与癌细胞不同，M1巨噬细胞中的代谢重编程已经演变为以快速诱导性、强适应性和可逆性为特点的细胞过程，可以快速响应于微环境转录机制的激活、终止和效应功能。并且M1巨噬细胞的增殖很慢或者几乎不增殖，因此M1巨噬细胞的代谢重编程肯定是为增殖以外的细胞功能服务，例如为合成和分泌广泛的免疫介质的生物合成活动服务。

M1巨噬细胞中增加的有氧糖酵解能弥补线粒体呼吸减弱而导致的ATP合成减少，以维持细胞ATP水平。除了提供能量外，ATP还被认为是维持线粒体膜电位(称为Δψm)的一个关键[30]。在线粒体呼吸减少的情况下，Δψm会崩溃，进而引发细胞色素C释放，并伴随细胞凋亡。但是，已经证明Δψm可以通过ATP合酶逆转得以保持，在这种条件下，ATP合酶水解糖酵解产生的ATP，同时从线粒体基质中挤出质子，线粒体变成ATP的消费者而不再是ATP的生产者[31-32]。这种ATP合酶逆转维持线粒体完整性的机制在各种病理条件下发生[31-32]。这表明了有氧糖酵解是M1巨噬细胞维持Δψ的先决条件从而防止细胞凋亡。同时，保持线粒体完整性有利于TCA循环中间体(如琥珀酸盐和柠檬酸盐)的持续积累，代谢适应也能允许M1巨噬细胞在缺氧环境(例如炎性缺氧)中存活和维持功能。

在TCA循环减少的情况下积累的代谢物(如琥珀酸盐和柠檬酸盐)和缺氧诱导因子-1(HIF-1)可以共同促进炎性基因的表达[5]。在线粒体功能降低条件下所增加的活性氧物质(ROS)也可以增加炎症基因的表达[20,33]。有氧糖酵解下游产生的代谢产物(例如乳酸)可能会通过旁分泌信号影响其他巨噬细胞和组织细胞[10]。此外，M1巨噬细胞越来越依赖于葡萄糖和其他营养物质，例如谷氨酰胺。代谢重编程还可能决定巨噬细胞的寿命。或者，类似于癌细胞，巨噬细胞也可以成为自养生物(即独立于外部来源)，通过诱导特定的代谢补救途径来产生某些底物，营养物和代谢物(例如从瓜氨酸和天冬氨酸代谢中回收L-精氨酸)，它们可以保持功能性并且使巨噬细胞在营养缺乏的微环境中延长存活[23]。

Haschemi等[8]证明LPS促进葡萄糖通过糖酵解途径和磷酸戊糖途径(PPP)代谢，进入磷酸戊糖途径的葡萄糖可重新进入糖酵解的上游并继续生成乳酸或进入TCA循环。同时，葡萄糖进入PPP，能产生氧化反应所需的NAPDH和谷胱甘肽，以抵抗巨噬细胞中活性氧(ROS)的氧化作用。另外，PPP途径的增加还为核苷酸的合成提供原料。高表达碳水化合物激酶样蛋白(CARKL)使PPP通量减少，糖酵解通量减少，LPS诱导的细胞因子和ROS产生减少，Haschemi等[8]发现LPS抑制CARKL，导致通过PPP的通量增加，拮抗上述反应，这些发现都表明CARKL是一种在巨噬细胞代谢重编程中的重要调节因子。

6 代谢重编程对巨噬细胞的可塑性和功能影响在疾病中的应用

可以大胆推测，线粒体代谢的改变其实是线粒体另一个关键的功能，其可以调节巨噬细胞的激活和可塑性。因此，充分了解相关疾病状态下代谢异常的状态将有助于疾病的治疗。

在多种炎症性疾病中，巨噬细胞是影响疾病结果的主要细胞。例如，癌细胞和肿瘤浸润性免疫细胞(例如巨噬细胞)之间存在复杂的相互作用。这些所谓的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤中最突出的免疫细胞之一。癌症已被评估为以代谢特征为治疗靶标的良好实例。癌细胞由于其高度增殖潜力，与非恶性细胞相比具有明显不同的代谢特征。特异性靶向癌细胞的代谢途径的几种药物正在临床试验中[32]。在动脉粥样硬化中，M1巨噬细胞是重点参与斑块形成的细胞[34]，在动脉粥样硬化小鼠模型中，诱导巨噬细胞的M1极化将增强疾病进展。因此，应该尽量使巨噬细胞向M2极化使其对动脉粥样硬化疾病有益。研究表明，通过miR-33抑制使高胆固醇血症小鼠的巨噬细胞上调，可以使巨噬细胞进入M2状态并减少动脉粥样硬化，该研究强调了影响巨噬细胞的代谢重编程将影响疾病的结果[35]。除此之外，在代谢疾病(例如肥胖)中干扰巨噬细胞代谢也引起了研究人员的关注。脂肪组织巨噬细胞(ATM)占瘦小鼠和正常人类中所有脂肪组织细胞的不到10%，但它们在极度肥胖小鼠中的比例提高了50%以上，在肥胖人类中提高了近40%[36]。其表型适应不断变化的微环境，瘦脂肪组织中的巨噬细胞被认为是抗炎性M2巨噬细胞，通过清洁细胞碎片和脂质缓冲起到维持脂肪组织稳态的作用[37]。肥胖脂肪组织中的巨噬细胞为促炎性M1巨噬细胞，并且被认为是肥胖诱导的胰岛素抵抗的主要原因。ATM在肥胖机体内暴露于脂质，导致慢性脂质超载。因此，代谢触发可导致炎性巨噬细胞活化,干扰代谢过程是一种可以抑制促炎ATM表型并有利于恢复肥胖中的脂肪组织稳态[38]。可见，过度活化的促炎性巨噬细胞通常有助于炎症性疾病(例如动脉粥样硬化和肥胖症)的疾病进展。因此，抑制其促炎活性将是治疗这些疾病的有利方式。

7 结语与展望

代谢重编程伴随着糖酵解增加，线粒体氧化磷酸化减少，TCA循环重新排列，促进生成中间体(例如琥珀酸盐、柠檬酸盐)以及ROS和NO，它们分别在旁分泌信号中增加了巨噬细胞产生炎症反应和参与的能力。除了增加糖酵解和重编程TCA循环以外，修饰的苹果酸盐-天冬氨酸盐循环，上调的精氨琥珀酸-瓜氨酸-精氨酸循环之间的合作也对于使炎性巨噬细胞激活至关重要。增加有氧糖酵解的能力似乎也是保持线粒体膜电位(ΔΨm)的一个关键，从而预防细胞凋亡并且维持ROS、NO、琥珀酸盐和其他代谢物等的持续产生。

然而，在巨噬细胞代谢研究中未来还存在一些挑战。其中之一是选择性地靶向巨噬细胞或寻找影响疾病的代谢靶标将比较困难。另一方面，巨噬细胞应被视为动态细胞，在不同的疾病阶段其表型可能不尽相同，其动态的代谢状态可能也将妨碍代谢靶向。此外，大多数巨噬细胞代谢研究在体外完成。然而，在炎症或肿瘤发展过程中，巨噬细胞必须处于特定的微环境中。因此，应将推进专业实验技术的发展，如体内示踪剂分析等，将巨噬细胞代谢研究进一步推向体内水平。未来，我们期待以巨噬细胞代谢为靶标在炎症性疾病和癌症方面的治疗具有革命性的发现和发展。