广东省番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定及序列分析

汤亚飞 佘小漫 李正刚 于琳 蓝国兵 邓铭光 何自福

摘要 番茄黄化曲叶病毒病是世界番茄生产上一种毁灭性病害，番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）是引起该病害的主要病原病毒之一。本文采用滚环扩增及基因克隆方法，获得了侵染广东佛山和肇庆番茄的TYLCV 4个分离物全基因组;它们均为2 781 nt，编码6个ORF，其中病毒链上编码AV1和AV2，互补链上编码AC1、AC2、AC3和AC4。同源性比较结果表明，4个广东分离物基因组序列两两间同源性为99%以上;与已报道的TYLCV各分离物同源性在90%以上，而与来自中国不同地区的TYLCV分离物的同源率均在98%以上。系统进化分析显示，广东分离物与来自中国不同地区的TYLCV分离物亲缘关系较近，并聚类在一个分支。因此，侵染引起广东佛山和肇庆番茄黄化曲叶病的病毒应来自国内其他地区。本研究是对TYLCV广东分离物分子特征的首次报道。

关键词 番茄黄化曲叶病毒; 分子鉴定; 序列分析

中图分类号： S 432.41

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018333

番茄黄化曲叶病是世界范围内严重影响番茄生产的一种重要病害，已给热带和亚热带地区的番茄生产造成严重损失[1]。在我国，蔡健和等1994年首次在广西报道了该病害的发生[2]。2006年以来，番茄黄化曲叶病在全国范围大面积暴发和流行。在广东，何自福等2003年率先报道番茄黄化曲叶病危害番茄[3]，到目前为止，广东省几乎所有番茄产区均有该病害的发生。番茄植株感染该病害后主要表现为植株矮化，叶缘黄化，叶片皱缩、卷曲。早期感病时，植株无法正常开花结果;后期感病，植株上部新叶表现症状，结果量减少，果实变小[4]。

番茄黄化曲叶病是由烟粉虱传双生病毒侵染所导致的。全世界已报道可侵染番茄的双生病毒至少有88种[5]，在我国，已报道的引起番茄黄化曲叶病的双生病毒至少有16种[616]，其中TYLCV分布最广，是引起全球各地番茄黄化曲叶病的主要病原之一。该病毒最先在以色列发现，之后随着传播介体烟粉虱在全球范围暴发而蔓延至中东、地中海沿岸、非洲、美洲、澳洲和亚洲等多个国家和地区[17]。在我国，Wu等2006年首次在上海番茄上发现TYLCV[6]，之后在北京[18]、河北[19]、吉林[20]、陕西[21]、天津[22]、河南[23]、浙江[24]、江苏[25]、新疆[26]、山东[27]、安徽[28]、福建[29]、湖北[4]、湖南[30]、云南[31]、山西[32]、辽宁[33]、宁夏[34]、甘肃[35]等20个省市番茄产区均有检测到该病毒，并造成严重损失的报道。在广东，2004年即有番茄黄化曲叶病的发生，但直到2011年9月才在佛山市三水区的番茄产区检测到TYLCV。本文对危害广东番茄的TYLCV全基因组进行了克隆及序列分析，明确了TYLCV广东分离物的分子特征，为该病毒病监测与防控提供了依据。

1 材料与方法

1.1 供试样品

罹患番茄黄化曲叶病的番茄叶片样品采自广东省佛山市三水区、肇庆市高要市等番茄产区;以TYLCV侵染性克隆注射接种发病的番茄植株叶片作为阳性对照，以健康番茄植株叶片作为阴性对照。

1.2 供试番茄样品总DNA提取

取番茄病叶组织100 mg，用北京全式金生物技术有限公司的植物DNA提取试剂盒（Easy Pure Plant Genomic DNA Kit）抽提其总DNA。具体操作按照试剂盒说明书进行。DNA沉淀溶解于50 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L EDTA， pH8.0）溶液中。

1.3 PCR 检测

利用菜豆金色花叶病毒属病毒通用简并引物AV494/CoPR[3637]，对疑似病样进行PCR检测。反应体系为：番茄病样总DNA 1 μL（约20 ng），灭菌水 9.5 μL，PCR Mixer 12.5 μL（TaKaRa公司），10 μmol/L上、下游引物各 1 μL，总体积为 25 μL。反应程序：94℃ 4 min;94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环;72℃ 10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 全基因组序列的扩增

取PCR检测为阳性的病样总DNA，分别取1.0 μL（约20 ng）为模板，利用TempliPhiTM RCA Kit （GE Healthcare）进行滚环扩增（rolling circle amplification，RCA），以获得病毒的全基因组。具体方法按照试剂盒说明书上的步骤进行。RCA反应结束后，扩增产物分别用BamH Ⅰ限制性内切酶进行酶切。酶切反应体系为：RCA产物2 μL、内切酶1 μL、10×内切酶缓冲液1 μL，总酶切反应体系为10 μL。在37℃条件下酶切2 h以上，然后进行电泳分析。若酶切产物为2.5～3.0 kb，或同时还产生1.3 kb左右的条带，则克隆這些特异性条带。

1.5 基因克隆与序列分析

应用琼脂糖凝胶回收试剂盒（Thermo公司）回收RCA酶切产物，纯化后连接到相应酶切的pGEM-3Z载体，并转化大肠杆菌菌株DH5α，每个平板随机挑取3个阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。利用DNAStar软件（DNASTAR Inc，Madison，USA）的SeqMan对所获得的基因序列进行拼接，利用BLAST程序进行序列相似性搜索，进一步用DNAStar的MegAlign进行序列比较分析，ORF预测使用NCBI网站的ORF Finder，采用MEGA 5.05的邻接法（neighbor joining，NJ），设置Bootstrapping值为1 000，构建进化树。

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果

利用菜豆金色花叶病毒属病毒特异简并引物AV494和CoPR进行PCR检测，从采集的疑似番茄黄化曲叶病样品的总DNA中均扩增到1条与阳性对照大小一致的特异片段，长度为570 bp，而健康植株样品总DNA中未扩增出任何片段（图1）。表明疑似病样中均含有菜豆金色花叶病毒属病毒。

2.2 病毒分离物基因组的克隆与序列分析

选取PCR检测为阳性的病样总DNA，分别进行RCA和酶切反应，RCA产物均能被BamHⅠ切出1条约2.7 kb大小的单一条带，将2.7 kb大小的条带进行分子克隆和序列测定，结果表明，来自广东番茄的SS11、SS12、SS13、GY01 4个分离物 （GenBank登录号为：JQ867092、JX128099、KC810892、KF356163）全长大小均为2 781 nt，且两两间序列同源率均为99.0%以上。

进一步分析发现，侵染广东番茄的4个菜豆金色花叶病毒属病毒分离物基因组DNA-A结构特征完全一致，为单链闭合环状，编码6个ORFs。基因组病毒链含AV1基因 （308-1 084 nt，编码CP）和AV2基因 （148-498 nt，编码与病毒移动相关蛋白），互补链含有AC1基因（1 542-2 615 nt，编码复制酶）、AC2基因（1 226-1 633 nt，转录激活蛋白）和AC3基因（1 081-1 485 nt，编码复制增强蛋白）和AC4基因（2 171-2 464 nt，编码复制或转录调控因子）。在AV2与AC1之间有1个313 nt的非编码区（位于2 616-147 nt），其中含有与双生病毒复制起始有关的保守序列TAATATTAC（位于2 775-2 nt）[38]。

BLAST结果显示，与广东分离物 DNA-A序列有较高相似性的序列均为TYLCV分离物。进一步比较发现（图2），广东分离物与来自我国不同地区的TYLCV 13个分离物以及国外不同国家来源的TYLCV 19个分离物的相似性均为90%以上;其中与来自中国不同地区的TYLCV 13个分离物的相似性均在98%以上，而与阿曼Tom-48分离物（登录号：KF229725）相似性最低，为90.2%。

2.3 亲缘关系分析

为了分析TYLCV广东分离物与已报道的各TYLCV分离物的亲缘关系，将TYLCV广东分离物及上述32个分离物构建系统进化树，以侵染广东番茄的台湾番茄曲叶病毒Tomato leaf curl Taiwan virus（ToLCTWV）白沙分离物（DQ237918）为外组。结果显示（图3），TYLCV 广东分离物与来自中国不同地区的13个分离物及国外的11个分离物亲缘关系较近，聚在一个分支，进一步与科威特KISR分离物形成一个大的分支;与日本Mild[Tokai]分离物、西班牙Mild[Spain7297]分离物、留尼汪岛分离物、日本Sz分离物4个分离物的亲缘关系较近，而与阿巴代分离物、伊朗分离物及阿曼Tom-48分离物 3个分离物亲缘关系较远。

3 讨论

本研究采用RCA扩增及基因克隆方法，获得了侵染广东佛山和肇庆番茄的双生病毒4个广东分离物基因组全序列，大小均为 2 781 nt，序列间相似性为99%;这些分离物与TYLCV 13个中国分离物及19个不同国家来源分离物的相似性均大于90%，且与TYLCV 13个中国分离物的相似性均在98%以上。根据目前国际双生病毒分类方案[5]，侵染引起广东佛山和肇庆番茄黄化曲叶病的病毒应该属于TYLCV分离物。

TYLCV最早发现于以色列，之后迅速扩散，现已在全球范围发生。国内最早于2006年在上海番茄上检测到，随后成为我国番茄黄化曲叶病的主要病原病毒之一。2003年在广东首次发现了番茄黄化曲叶病[3]。自从该病害发生以来，本团队一直对广东省该病害的发生和病原病毒种类进行鉴定和监测，2011年以前，引起广东省番茄黄化曲叶病的病毒种类为广东番茄曲叶病毒Tomato leaf curl Guangdong virus（ToLCGdV）、广东番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl Guangdong virus（TYLCGdV）和ToLCTWV 3種病毒[1113]。 2011年9月，首次在佛山市三水区的番茄产区上检测到TYLCV，随后2013年在肇庆市高要市蚬岗镇番茄也检测到该病毒。可见，TYLCV也入侵广东危害番茄，正在成为引起广东番茄黄化曲叶病的病原病毒之一。 更进一步的序列分析发现其与侵染中国其他地区番茄的TYLCV相似性高，亲缘关系近。因此，推测侵染广东番茄的TYLCV病毒是从国内其他发生TYLCV的地区通过蔬菜、种苗运输以及烟粉虱的扩散等途径传入、定殖。

本文首次对侵染广东省番茄的TYLCV进行分子鉴定和序列分析，明确TYLCV广东分离物的分子特征，对开展TYLCV在我国的扩散、序列变异与进化等方面研究提供了基础，同时也为广东省番茄抗病新品种的选育及番茄黄化曲叶病的防控提供了科学依据。

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（责任编辑：田 喆）