中国不同地区草地贪夜蛾种群生物型分子特征分析

张磊 柳贝 姜玉英 刘杰 吴孔明 萧玉涛

摘要 原产于美洲的草地贪夜蛾已入侵我国，对我国粮食生产安全构成重大威胁。在美洲，该虫的寄主类型、迁飞行为以及抗药性等方面因群体分化而存在较大差异。本研究利用2个分子标记对中国13省（市、自治区）131个县市的318份样品进行群体遗传特征比较，基于线粒体COⅠ基因分析结果显示96%以上为水稻型，玉米型比例不到4%，且中国样品COⅠ序列特征与美国佛罗里达州种群有很高的一致性，而基于核基因组Tpi基因分析结果表明所有样品单倍型特点均表现为玉米型。分析认为，入侵我国的草地贪夜蛾群体很可能来自一个水稻型母本和玉米型父本杂交群体的后代，在长期的演化扩散过程中，玉米型的核基因组占据了主导地位，从而成为一种特殊的玉米型。厘清入侵中国的草地贪夜蛾具体的遗传特征属性，对于风险评估、精准监测和科学防控具有重要指导意义。

关键词 草地贪夜蛾; 群体演化; 水稻型; 玉米型; 杂交

中图分类号： S 435.132

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019296

联合国粮农组织全球预警的重大害虫草地贪夜蛾自2019年1月入侵中国以来，5个月时间内已扩散至18个省（市、自治区），大有席卷全国之势，给我国农业生产造成重大影响，国家粮食安全和生态安全受到严重威胁。

目前，草地贪夜蛾在我国主要为害玉米和甘蔗[1]，对其他作物的潜在危害造成的损失尚未确定。考虑到草地贪夜蛾在美洲的为害特征，其寄主植物多达80余种，对玉米、水稻、高粱、大豆、小麦、棉花、牧草等均造成较大的经济损失[23]，其危害的潜在风险巨大。草地贪夜蛾还存在寄主种类嗜好性差异，主要由于存在两种不同的亚型，通常称为水稻型和玉米型[45]，除此之外，迁飞行为[67]、农药抗性[89]以及对转基因作物的抗性[1011]也与不同地理群体相关。目前我国发生草地贪夜蛾的省份都是水稻种植区，水稻是否会受到为害引起高度关注。因此，对入侵我国的草地贪夜蛾进行群体遗传特征鉴定显得极为迫切。

分子标记是鉴定草地贪夜蛾不同亚型的主要手段，其中来源于线粒体的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）以及位于Z染色体上的磷酸甘油醛异构酶基因（triose-phosphate isomerase，Tpi），是当前最常用也是最成熟的标记基因[1221]。不同亚型之间的杂交行为在实验室以及田间均证实存在[2223]，由于线粒体具有母系遗传的特征，基于线粒体COⅠ基因的亚型鉴定具有一定的不确定性，而基于核基因组Z染色体的Tpi基因则表现出相对的稳定性[2425]。然而，关于草地贪夜蛾复杂的群体遗传动态分析，这两个标记依然是当前最合适的选择。

本研究采集我国13个省（市、自治区）131个县（市、区）的318份草地贪夜蛾样品，利用COⅠ和Tpi两个基因片段进行分子检测，鉴定具体生物型，并分析种群遗传特征。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本次研究的样品一共有318份，包含田间采集的幼虫和性诱的成虫。采集地点包括云南、广西、广东、四川、贵州、海南、湖南、福建、浙江、江西、上海、重庆、湖北13个省（市、自治区）131个县（市、区），样品采集时间为2019年3月11日至6月11日，寄主植物主要为玉米，少数样品取于苏丹草或水稻。幼虫样品收到后用75%乙醇浸泡30 min，随后常温运送至实验室，成虫样品保持干燥，常温运送至实验室。各县市具体样品信息见表1。

1.2 PCR扩增及测序

成虫或幼虫单头虫体用液氮研磨成粉后，采用Multisource Genomic DNA Miniprep Kit试剂盒进行DNA提取，DNA经过1%琼脂糖电泳检测，使用NanoDrop ND-2000仪器测定浓度。根据已发表引物和PCR扩增方法[26]，分别对COⅠ基因和Tpi基因片段进行扩增，使用1%琼脂糖电泳检测扩增结果，PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3 数据分析

利用BioEdit软件查看测序序列峰图，去除两端低质量序列，区分杂合位点，获得准确的基因片段序列。从GenBank数据库下载全球各代表性地区草地贪夜蛾COⅠ基因核酸序列。所有序列采用MEGA 5.0软件进行比对，删除两端不对齐序列，选取Kimura-2参数模型，以邻接法（neighbor joining，NJ）构建系统进化树，系统树各分支的自举检验值（bootstrap）由1 000次重复检验获得。针对玉米型和水稻型Tpi基因序列单倍型差异特点[25]，运用DNAMAN软件进行特异位点比对分析。

2 结果与分析

通过对COⅠ基因序列进行比对分析，从318份样品中鉴定出水稻型和玉米型两种基因型，其中水稻型306份，占96.2%，玉米型不到4%（表1）。可见以COⅠ基因作为分子标记，水稻型在群体数量上占绝对主导。

将本研究测定的COⅠ基因序列与NCBI公布的北美美国、南美巴西、非洲南非、亚洲印度等的草地贪夜蛾的COⅠ序列进行比对，以棉铃虫Helicoverpa armigera COⅠ序列作为外群构建系统进化树（图1）。由于我国所有样品中属于同一基因型的样品序列高度一致，我们仅各选取1条序列（strain 1和strain 2）进行比对分析，结果表明，中国样品strain 2的COⅠ序列与印度、南非、美国佛罗里达种群的序列一致，与巴西以及美国的另一种群的序列有一定差别。虽然整个分支均为水稻型，但是从进化树也可看出，美洲不同地域种群的序列之间存在一定程度变异。在玉米型分支中，中国样品strain 1与南非以及美国佛罗里达种群的序列一致。与水稻型分支类似，来自美国不同地区的玉米型的COⅠ序列也表現出一定的差异。

我们比对所有样品Tpi基因序列，针对水稻型和玉米型10个差异单倍型位点进行分析，除了部分样品在2个位点显示为杂合外（图2），其余样品均只显示一种基因型，并且均与玉米型单倍型特征相符合，该结果表明基于Tpi基因的序列分析显示所有样品均为玉米型。

3 讨论

草地贪夜蛾在原产地美洲由于取食寄主植物的不同分化出玉米型和水稻型两种亚型，玉米型偏向取食玉米、甘蔗、高粱、谷子、棉花、大豆、花生等，而水稻型偏向取食水稻、各种牧草等。两种亚型在形态学上完全无法区分[5， 27]，通过COⅠ和Tpi等分子标记进行鉴定一直是主流方法，能够根据不同亚型单倍型特点将绝大多数水稻型和玉米型有效区分[1214， 2425]。此外，不同亚型在长期进化过程中，形成了一些特定的群体，包括对农药的抗性群体以及针对转基因作物的抗性群体，这些群体的鉴定也多依赖于分子辅助检测手段[9， 11]。

在前期工作中，我们利用COⅠ和Tpi两种分子标记联合检测，发现入侵我国云南的82份草地贪夜蛾幼虫样品具有完全一致的基因型，并且通过Tpi基因单倍型位点比对分析鉴定为玉米型[26]。在本研究中，我们扩大了样品采集地区，大大增加了样本数量，不仅包含了各龄期幼虫和成虫，还覆盖了不同类型的寄主植物，运用相同的方法对入侵我国的草地贪夜蛾群体遗传特征进行了更进一步的研究。分析结果表明入侵我国的草地贪夜蛾具有两种COⅠ基因型，而基于Tpi基因的结果显示均为玉米型，仅仅部分样品在2个位点表现出杂合现象，使用两种分子标记鉴定出现了不一致的结果。由于线粒体属于母系遗传，后代仅能遗传母本的线粒体DNA，且两种亚型之间并不存在绝对的生殖隔离，雌性水稻型和雄性玉米型的交配行为在实验室和田间均被证实存在[23]，因此分析认为，本研究中的不一致是由于水稻型母本和玉米型父本杂交产生，导致后代获得了水稻型线粒体的COⅠ基因序列，但是核基因组在长期的繁衍扩散过程中更多地保留了玉米型的背景基因组，从而演化成特殊的玉米型。本研究中占主导的96%的样品为一个杂交型群体的后代，由水稻型母本和玉米型父本杂交后代演化而來。由于在我国所有样品中均未检测出完全符合水稻型Tpi基因单倍型，因此推测该杂交发生在入侵我国、甚至是入侵非洲之前。

通过构建基于COⅠ基因的系统进化树，我们发现入侵我国的草地贪夜蛾与南非、印度以及美国佛罗里达的草地贪夜蛾聚为一支，序列比对也表明具有完全一样的基因型。在美洲，根据COⅠ基因单倍型频率可以将玉米型草地贪夜蛾分为佛罗里达（FL-type）和德克萨斯（TX-type）两个地理型亚群，其中TX-type广泛分布在南美、墨西哥和美国大部分地区，FL-type限于佛罗里达、加勒比海地区和美国东海岸[2830]。已有研究报道显示，入侵非洲的草地贪夜蛾群体很可能是通过贸易往来被带入非洲的一小部分群体繁衍扩散形成的[2]。由于在美洲已有少量关于杂交型群体后代的报道[22]，因此极有可能是来自美国佛罗里达的杂交演化群体后代传入非洲。从进化树可以看出，中国草地贪夜蛾与非洲草地贪夜蛾COⅠ基因序列完全一致，且主导型比例相同[15，31]，因此我们推断草地贪夜蛾入侵非洲之后，不断扩散，随后进入西亚，持续往东扩散至东南亚地区，最后通过中缅边境侵入我国，呈现扩散暴发态势。

虽然目前有部分研究报道水稻型在非洲和亚洲也存在，但是仅仅是基于COⅠ单基因或多个线粒体来源的基因鉴定[15，17]，对于Tpi基因的分析也是根据个别变异位点的判断[16]，基于PCR的一代测序也可能会由于扩增或测序误差造成碱基差异。在本研究中，部分样品Tpi基因也存在2个位点的杂合（图2），由于草地贪夜蛾性别决定属于ZW型，Tpi基因位于Z染色体，因此可能会因为雌性（ZW）或者雄性（ZZ）个体性别差异造成杂合。

通常情况下，背景单一的小种群长期的近交会经历种群瓶颈效应，容易造成遗传衰退[32]。而侵入我国的草地贪夜蛾的祖先具有杂交背景，后代理论上可能具有某种程度的杂交优势，显示出更强的适应性;也可能由于杂交而产生一定的适合度代价，导致自身抵抗能力下降。值得注意的是，侵入我国的草地贪夜蛾在取食行为以及为害特征上可能与传统的玉米型有所差异，包括农药抗性和对转基因作物的抗性遗传特征会相应改变，因此仅仅通过连锁分子标记检测可能造成一定偏差，还需要结合更加完整的生物测定进行判断。对于这一新的玉米型草地贪夜蛾，在防控措施上可能要更加的谨慎。鉴于入侵群体祖先经历过杂交，理论上存在进化出水稻型的可能性，还需要进一步基因组测序的数据来论证，因此需要对水稻作物进行更加严密的监控。

目前我国发现受害作物主要有玉米，部分省份有甘蔗、高粱和少量的谷子、花生，均属于玉米型寄主植物。四川省合江县植保站4月30日在水稻秧苗捕捉到几头高龄草地贪夜蛾幼虫（COⅠ基因鉴定为草地贪夜蛾，但是Tpi基因无法扩增），湖南农业大学李有志教授5月13日在湖南省岳阳市平江县稻田发现在3 m2的范围内有17头4龄期幼虫，并且都在稻株上进行取食，后来当地植保部门普查未在稻田见有为害。推测为低龄幼虫吐丝扩散至水稻植株上，或迁入成虫在无法搜寻到最适寄主玉米的情况下，被迫选择水稻产卵，因此应是环境胁迫造成的偶然事件。

总的来说，目前我国发生的草地贪夜蛾存在两种线粒体COⅠ基因型，且比例差异悬殊。然而两种基因型所代表的群体之间是否有杂交，在雌雄交配选择上是否有偏好性，需要更进一步的研究。此外，本研究中有多份样品仅能得到COⅠ扩增片段，而采用Tpi引物无法扩增出有效片段，可能是由于样品DNA质量较差，也不排除具有更加复杂的基因组背景特征，需要采用全基因组分析手段，选取更多的位点，针对水稻型和玉米型两种亚型基因组差异特征[33]，进行具体的测序分析和位点比对，更加深入地挖掘入侵我国的草地贪夜蛾的遗传特征，为其防控提供更加准确的信息。我国当前对于草地贪夜蛾的群体遗传研究有限，亟待更多的数据支持。还应密切跟踪非洲、亚洲等国家水稻型扩散动向，提高我国防范该类型草地贪夜蛾的主动性。

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（責任编辑：杨明丽）