GFPT2在胃癌中的表达及作用的研究

胃癌是全球常见的恶性肿瘤，每年约有100万患者被确诊[1]。饮食习惯、肥胖、吸烟、慢性感染尤其是幽门螺杆菌(Hp)感染都会导致胃癌发生[2-3]。在中国，由于胃癌患者确诊时多数是晚期，故疗效不佳，5年生存率较低[4]。因此，寻找能预测早期胃癌和转移相关的标志物以及有效治疗胃癌的新靶点具有重要意义。谷氨酰胺果糖-6-磷酸转氨酶2(GFPT2)基因位于染色体 5g34～5g35.2 区域，在冰岛糖尿病家系研究中发现该区域与糖尿病有关[5]，支持GFPT2是2型糖尿病的候选基因。与非侵袭性上皮细胞株相比，具有高度侵袭性的乳腺癌细胞株中GFPT2表达的升高[6]。GFPT2表达的升高还与2型糖尿病有关[7]。而目前尚未见GFPT2与胃癌关系的研究报道，本研究主要探讨GFPT2在胃癌组织中的表达情况及作用。

1 材料和方法

1.1 组织标本和细胞系

选择2014年1月至2015年6月在乐山市人民医院接受胃切除手术、切除标本经病理诊断为胃癌的82例患者，其中男性49例，女性33例，年龄23～72岁，平均年龄(56.2±4.56)岁，收集82例患者的配对胃癌及癌旁正常组织(距离肿瘤边缘5 cm)石蜡标本。另收集2017年6月至2018年7月在乐山市人民医院胃肠外科经手术切除的33例患者配对的新鲜胃癌组织及癌旁正常组织。正常胃黏膜上皮细胞株GES和胃癌细胞株MGC803、MKN45、BGC823、AGS由南方医科大学病理学系任小莉博士提供。细胞培养用加入10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基，培养皿置于37 ℃、5%CO2培养箱中。

1.2 Real-time PCR检测GFPT2 mRNA的表达水平

收集细胞，按Trizol 和反转录试剂说明书分别提取RNA 及反转录合成cDNA。引物序列见表1。PCR反应体系10 uL，反应条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。目的基因以2-ΔΔCt表示，目的基因引物由Sangong Biotech公司合成。

表1 引物序列

1.3 Western blotting检测GFPT2蛋白的表达水平

总蛋白经SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜上。将膜置于GFPT2一抗过夜(1∶500)。漂洗一抗后，室温孵育兔二抗(1∶10 000)1 h。PBST洗膜3次，每次10 min，加入化学发光物和显色试剂，于暗室中曝光、显影、定影。GAPDH为内参。

1.4 免疫组织化学检测GFPT2蛋白的表达水平

将胃癌及癌旁正常组织石蜡标本进行3 μm连续切片，采用过氧化物酶标记的链霉卵白素SP法染色。枸橼酸盐高温高压5 min进行抗原修复，DAB显色。以细胞质内出现淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为GFPT2阳性细胞，阳性细胞占肿瘤细胞的比例为阳性率。由2名以上病理医师(主治医师)独立评分，评分结果取平均值。根据物镜下肿瘤细胞阳性染色范围分为4个等级：阳性率<5%为0分，5%～30%为1分，31%～70%为2分，>70%为3分；依据对每张切片阳性细胞的染色强度进行评定，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。上述两个计分的乘积为染色的评判结果：0分为阴性(-)，统计时记为0分；1～4分为弱阳性(+)，统计时记为1分；5～8分为阳性(++)，统计时记为2分；9～12分为强阳性(+++)，统计时记为3分。每张切片随机选取5个高倍视野进行统计分析并取均值。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差表示，采用独立样本t检验。所有检验均为双侧检验，P<0.05 为差异有统计学意义。胃癌组织石蜡切片中GFPT2蛋白表达水平与临床病理参数的相关性采用Wilcoxon Signed Ranks检验分析和Spearman相关分析。

2 结果

2.1 配对新鲜组织标本中GFPT2 mRNA的表达水平

将33例配对的新鲜胃癌组织及癌旁正常组织进行Real-time PCR检测。设定癌旁正常组织中GFPT2 mRNA表达水平为1，采用 2-ΔΔCT公式计算胃癌组织中GFPT2 mRNA的相对表达量。结果显示33例患者的新鲜配对组织中，有27例胃癌组织中GFPT2 mRNA水平高于癌旁正常组织(t=2.891，P=0.007，图1A)，并且伴有肝转移的胃癌组织中的GFPT2 mRNA水平高于不伴有肝转移的胃癌组织(P=0.0015，图1B)。

图1新鲜配对组织标本中GFPT2 mRNA表达水平A33对新鲜胃癌组织及癌旁正常组织中GFPT2 mRNA的表达水平B伴有肝转移和不伴有肝转移的胃癌组织中GFPT2 mRNA表达水平比较

2.2 配对胃癌组织及癌旁正常组织石蜡切片中GFPT2蛋白表达水平

GFPT2蛋白表达定位于细胞质，胃癌组织中GFPT2表达阳性率为98.45%，平均表达强度为2.06±0.852 5，癌旁正常黏膜组织中GFPT2表达阳性率为20.60%，平均表达强度为0.79±0.563 3，根据染色范围及染色强度的乘积结果进行统计分析，结果显示胃癌组织中GFPT2蛋白表达要明显高于癌旁正常组织，两者差异有统计学意义(Z=-7.18，P<0.001)。见图2。

图2癌旁正常组织和胃癌组织石蜡切片中GFPT2蛋白的表达A癌旁正常组织 ×200B胃癌组织 ×200

2.3 胃癌组织石蜡切片中GFPT2蛋白表达与临床病理参数的相关性分析

结果显示，胃癌组织中GFPT2蛋白表达的高低与肿瘤分化程度、是否有远处转移及淋巴结转移有关(P<0.05)，与患者的性别、年龄、肿瘤浸润深度无关(P>0.05)。见表1。

表1 胃癌组织中GFPT2蛋白表达与临床病理参数的相关性/例

2.4 细胞株中GFPT2 mRNA和蛋白的表达水平

采用Real-time PCR法检测出5种细胞株中GFPT2 mRNA表达水平的CT值，将正常胃黏膜上皮细胞株GES中GFPT2 mRNA表达水平设定为1，采用2-ΔΔCT公式计算各细胞株中GFPT2 mRNA的相对表达量。结果显示，与正常胃黏膜上皮细胞株GES相比，胃癌细胞株MGC803、MKN45、BGC823和AGS中GFPT2 mRNA表达水平更高(P<0.05)。此外，高转移潜能胃癌细胞株MKN45和BGC823 中 GFPT2 mRNA的相对表达量分别为9.809 0±1.505 2、5.825 6±1.469 0，低转移潜能胃癌细胞株AGS及MGC803中GFPT2 mRNA的相对表达量分别为3.423 3±0.846 5、1.842 6±0.282 9。上述结果提示胃癌细胞株中GFPT2 mRNA的表达水平明显高于正常胃黏膜上皮细胞株GES，且高转移潜能胃癌细胞株中GFPT2 mRNA的表达水平较低转移潜能胃癌细胞株高(P<0.05)。进一步提取上述5种细胞株的总蛋白进行Western blotting法检测，结果显示正常胃黏膜上皮细胞株GES中GFPT2蛋白表达水平低于胃癌细胞株MGC803、BGC823及MKN45(P<0.05)，但与AGS的差异无统计学意义；高转移潜能细胞株MKN45和BGC823中GFPT2蛋白表达水平高于低转移潜能细胞株AGS及MGC803(P<0.05)。见图3。

图3 5种细胞株中GFPT2 mRNA和蛋白的表达水平比较 A GFPT2 mRNA表达水平 B GFPT2蛋白表达水平

3 讨论

随着医疗技术的发展，胃癌发病率和病死率已明显下降，但其目前仍是世界第3位恶性肿瘤[8-10]。研究胃癌的发病机制，为临床提供新的治疗靶点具有重要的意义。

GFPT属于高度保守的基因，是氨基己糖途径(HBP)的第一个限速酶，该酶是由非连锁但高度同源的GFPT l和GFPT 2基因编码，使L-6-磷酸-谷酰胺果糖转化形成6-磷酸-氨基葡萄糖。而6-磷酸-氨基葡萄糖是蛋白和脂类糖基化中己醣胺的重要前体[11]。GFPT酶包括两个重要的结构域，谷氨酰胺酶结构域和合酶结构域，前者可使谷氨酰胺水解为谷氨酸和氨，后者可使6-磷酸果糖氨基化和异构化形成6-磷酸-氨基葡萄糖。GFPT1和GFPT2是相互独立的位于不同染色体上的两个基因，在不同组织中的表达也有所不同。胰腺、胎盘、睾丸中GFPT1的表达水平高于GFPT2，而在神经系统特别是脊髓中GFPT2的表达水平明显高于GFPT1[12]。以往文献已证明氨基葡萄糖可引起血糖毒性和胰岛素抵抗，GFPT表达的改变可引起糖尿病发生[13]。目前GFPT1被研究得较多，主要研究O-GlcNAc 糖基化修饰、胰岛素抵抗及GFPT1在肿瘤中的表达上调等[14-15]。此外，GFPT1的突变还与先天性肌无力综合征相关[16]。目前尚未见GFPT2在胃癌中的作用及机制的相关研究报道。

本研究中首先检测了GFPT2在33例配对新鲜胃癌组织及癌旁正常组织中GFPT2 mRNA的表达水平，结果显示胃癌组织中GFPT2 mRNA表达水平明显高于正常组织。本研究还检测了82例配对胃癌及癌旁正常组织石蜡标本中GFPT2蛋白表达情况。结果显示胃癌组织中GFPT2蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织，且GFPT2蛋白表达与肿瘤分化程度、远处转移及淋巴结转移密切相关，而与患者的性别、年龄、肿瘤浸润深度无关。这些结果说明GFPT2在胃癌组织中呈高表达且与胃癌转移密切相关。此外，本研究还检测了正常胃黏膜上皮细胞株GES 和 4 种胃癌细胞株(AGS、MGC803、MKN45和BGC823)中GFPT2 mRNA和蛋白的表达水平，结果显示GFPT2在胃正常黏膜上皮细胞GES中的表达最低，在低分化的转移潜能较高的胃癌细胞株MKN45和BGC823中的表达较高，这进一步说明了GFPT2在胃癌的转移中可能起着促进作用。以往研究显示，GFPT2与糖尿病的发生密切相关，是2型糖尿病的候选基因[5]。但其在肿瘤方面的文献较少，仅有几篇。在后续的研究中，将着重研究USP18促进胃癌侵袭和增殖的分子机制及其在临床治疗中的应用价值。

综上所述，本研究结果显示，GFPT2在胃癌组织中高表达，与胃癌的发生及转移密切相关，为临床治疗胃癌提供了一个潜在的新靶点，也为进一步研究奠定了良好的基础。