克罗恩病患者血清miR-223表达与炎性反应状态及预后的关系

克罗恩病(CD)是一种慢性胃肠道炎性疾病，其病因尚未完全明确[1-2]。CD在欧美国家的发病率较高，在中国的发病率较低，但近年来其发病率呈升高趋势[3]。CD的临床表现多样，包括腹痛、腹泻、便血及腹部肿块等，此外，部分患者可伴有发热、贫血、营养不良、口腔溃疡及关节肿痛等症状，严重者可发生肠梗阻、穿孔或大出血[4-5]。因CD的临床表现多样，且易反复发作，所以需对CD患者的疾病活动及预后进行长期监测。现有的监测CD疾病活动的方法多属于侵入性检查，不仅耗时，而且费用较高，并不适用于临床常规检查[6]。

微RNA(miRNA)是一类单链非编码RNA，目前多数miRNA已被证实具有调控细胞增殖、分化、迁移和侵袭等功能[7-8]。越来越多的研究表明，CD患者的外周血或组织的miRNA谱与健康人群存在差异[9-10]。本研究选取64例CD患者和53例同期健康体检者分别作为CD组和对照组，比较两组的血清miR-223相对表达量，并分析miR-223的相对表达量与CD炎性状态及患者预后的关系，以期为CD的临床诊疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年4月至2018年1月在青岛市第八人民医院被诊断为CD的89例患者作为研究对象，排除临床资料不完整者7例，随访失联者18例，最终纳入64例患者作为CD组。根据《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年，广州)》[11]对患者进行诊断，并经病理检查证实为CD。纳入标准：(1)患者临床症状、体征及影像学表现均符合CD，并经病理检查证实；(2)随访期间患者病情进展及治疗等均符合CD自然病程；(3)临床资料完整。排除标准：(1)合并恶性肿瘤；(2)未签署知情同意书；(3)随访失联；(4)合并感染性疾病。本次研究经医院医学伦理委员会批准。

64例CD患者中，男性42例，女性22例，平均年龄(46.37±8.91)岁；病变部位包括回肠末端27例，结肠10例，回结肠27例；其中38例处于活动期，26例处于缓解期；疾病行为无狭窄、无穿孔型55例，其中8例合并肛周病变，疾病行为狭窄型9例。另选择53例同期健康体检者作为对照组，其中男性36例，女性17例，平均年龄(46.28±8.20)岁。两组的性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 观察指标

收集并记录受试者的年龄、性别、炎性反应状态、病变部位、疾病行为、C反应蛋白(CRP)和红细胞沉降率(ESR)水平、肛周病变情况等信息。根据CD患者的一般情况、腹痛、腹泻及伴随关节痛、虹膜炎、坏疽性脓皮病、新瘘管、脓肿等计算CD活动指数(CDAI)[12]。根据CD患者内镜下溃疡直径大小、溃疡面积百分比、炎性病变侵犯肠段面积百分比、肠管狭窄情况和受累肠段数目这5个方面计算CD简化内镜评分(SES-CD)[13]。

1.3 血清miR-223表达量检测

抽取受试者肘部静脉血10 mL，3 500 r/min离心15 min，取上层清液于EP管中，-80℃环境下保存待验。应用总RNA提取试剂盒(德国罗氏公司)提取血清中总RNA，同时检测其吸光度值，若OD 260/280在1.8～2.0之间则进行后续实验。取2 μg总RNA置于Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(德国罗氏公司)中合成cDNA，并将合成的cDNA置于PCR仪中进行扩增。反应条件为：94 ℃ 预变性10 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt表示受试者血清中miR-223的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 预后随访及判断

CD患者确诊后，每个月通过电话或复诊等方式进行随访，了解患者的病情及预后情况。随访截止时间为2019年1月31日。若CD患者在随访期间出现腹腔脓肿、肠瘘、肠梗阻、肠穿孔、消化道大出血及复杂性肛瘘等并发症，或接受肠切除手术治疗，亦或因CD死亡，均视为预后不良；反之，则视为预后良好[14-16]。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 两组的血清miR-223相对表达量比较

CD组血清miR-223相对表达量为2.17±0.52，高于对照组(0.88±0.18)，差异有统计学意义(t=17.341，P<0.001)。

2.2 不同炎性反应状态CD患者的血清miR-223相对表达量比较

CD组中炎性反应状态处于缓解期的患者的血清miR-223相对表达量为1.70±0.21，低于活动期患者(2.49±0.40)，差异有统计学意义(t=9.204，P<0.001)。

2.3 CD患者血清miR-223相对表达量与CDAI和SES-CD的关系

CD组患者的CDAI、SES-CD分别为6(3，7)分和9(2，13)分。CD组的血清miR-223相对表达量与CDAI及SES-CD均呈正相关关系(rs=0.725，P<0.001；rs=0.700，P<0.001)。见图1。

2.4 影响CD患者预后的相关因素分析

随访结果显示，64例CD患者中有27例(42.19%)预后不良。以血清miR-223相对表达量评价CD患者预后的最佳截断点(2.13)为界，将其转换为二分类变量。通过比较预后不良组与预后良好组患者的临床资料，发现两组的年龄、性别、病变部位、CRP和ESR水平的差异无统计学意义(P>0.05)，两组的肛周病变、疾病行为和血清miR-223相对表达量的差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。将单因素分析结果显示差异有统计学意义的指标，包括肛周病变、疾病行为和血清miR-223相对表达量作为自变量，将预后是否良好作为因变量纳入Logistic回归分析，结果显示存在肛周病变(OR=2.164，95%CI: 1.185～4.023，P=0.015)、疾病行为狭窄型(OR=5.026，95%CI: 3.018～7.095，P<0.001)和血清miR-223相对表达量>2.13(OR=4.173，95%CI: 2.305～8.124，P=0.022)的CD患者的预后不良风险较高。

图1 血清miR-223的相对表达量与CDAI及SES-CD的相关性分析 A CDAI B SES-CD

指标预后不良组(n=27)预后良好组(n=37)χ2值P值年龄/岁0.1520.697 ≤4013(48.15)16(43.24) >4014(51.85)21(56.76)性别0.4660.495 男19(70.37)23(62.16) 女8(29.63)14(37.84)病变部位0.0990.952 回肠末端11(40.74)16(43.24) 结肠4(14.81)6(16.22) 回结肠12(44.44)15(40.54)CRP0.3700.543 升高21(77.78)31(83.78) 正常6(22.22)6(16.22)ESR0.1380.711 升高18(66.67)23(62.16) 正常9(33.33)14(37.84)肛周病变5.7200.017 有7(25.93)1(2.70) 无20(74.07)36(97.30)疾病行为3.8740.049 无狭窄、无穿孔型20(74.07)35(94.59) 狭窄型7(25.93)2(5.41)miR-223相对表达量5.1890.023 ≤2.139(33.33)23(62.16) >2.1318(66.67)14(37.84)

3 讨论

目前用于监测CD疾病活动常用的生物标志物有CRP和ESR，但两者的特异度和敏感度均较低[17]。因miRNA不易被降解，且可参与多种疾病的调节，如肿瘤和炎性反应等，故其可作为相应疾病的生物标志物[18]。Polytarchou等[19]的研究显示miR-223在溃疡性结肠炎患者外周血中高表达，但关于miR-223在CD患者外周血中表达情况的研究较少。肠镜检查是目前观察CD患者炎性反应状态较为直观的方法，取CD患者病变部位组织进行检查亦能评价其病理特征，但肠镜检查前CD患者需进行肠道清洁，不仅给患者带来不便，还增加了检查时间。血清学检测具有无创的特点，且操作简单。本研究探讨血清miR-223相对表达量对CD患者炎性反应状态和预后评估的价值，以期为CD的临床诊治提供参考。

本研究结果发现，CD组的血清miR-223相对表达量高于对照组，推测miR-223可能参与了CD的发生、发展过程。此外，本研究进一步发现，处于缓解期的CD患者血清miR-223相对表达量低于活动期CD患者。CDAI是基于CD患者临床症状、体征及相关并发症进行的评分，SES-CD是通过内镜观察CD患者的溃疡直径大小、溃疡面积百分比、炎性病变侵犯肠段面积百分比、肠管狭窄情况和受累肠段数目进行的评分，可直观评估病变部位的炎性反应情况。CDAI和SES-CD均能在一定程度上评估CD患者的疾病活动度。本研究结果显示，CD患者血清miR-223相对表达量与CDAI及SES-CD均呈正相关。上述结果表明miR-223与CD患者炎性反应状态关系密切，可能参与CD病情进展，检测CD患者血清miR-223相对表达量有助于了解CD患者的病情。

CD的预后是目前消化领域学者研究的热点和难点，及早了解影响CD预后不良的危险因素有利于在CD诊断后尽早进行相应干预，延缓病情进展，甚至治愈CD。本研究随访了64例CD患者的预后情况，发现27例患者预后不良。通过单因素及Logistic多因素回归分析，结果显示存在肛周病变、疾病行为狭窄型和血清miR-223相对表达量>2.13的CD患者的预后不良风险较高，此结论与杨荣萍等[20]的报道基本一致。本研究因未考虑CD患者的发病年龄、诊断年龄等因素，因此今后还需补充研究影响CD患者预后的相关因素，并进行大样本、多中心研究，以弥补本研究的不足。

综上所述，CD患者的血清miR-223相对表达量与其炎性反应状态及预后均有关。检测CD患者血清miR-223相对表达量有助于了解其病情及预后，便于临床医师采取针对性治疗。