FBXW10与Cyclin E在肾透明细胞癌中的表达及临床意义

王进有 何 可 谢栋栋 毕良宽 徐德祥 于德新

肾癌是泌尿系统常见肿瘤之一，绝大多数细胞类型为透明细胞癌，肾癌发病的确切机制仍未完全阐明，相关癌基因的表达和抑癌基因失活在肾癌发生、发展及转移中扮演重要角色[1-2]。F框/WD-40域蛋白家族(F-box and WD repeat domain-containing，FBXW)可通过泛素连接酶E3一系列作用将其靶蛋白泛素化降解。在这个家族蛋白中研究较多的是FBXW7，其处于蛋白网络调控的中心位置，在细胞分裂、细胞分化、细胞侵袭、细胞凋亡、肿瘤转移及肿瘤耐药等多个方面发挥重要功能[3]。

目前关于F框/WD-40域蛋白10(FBXW10)功能的研究较少，仅知道它是FBXW蛋白家族中的一个蛋白[4]。课题组前期研究表明FBXW10为抑癌基因，在泛素化降解中的功能可能与FBXW7相似[5]。细胞周期蛋白E(Cyclin E)是调控细胞周期进程的细胞周期蛋白家族中的一员，Cyclin E异常表达会导致基因组不稳定，从而引发肿瘤[6]。本研究拟通过免疫组化SP法检测60例肾透明细胞癌患者癌组织及其中行根治术的20例患者癌旁正常肾组织中FBXW10和Cyclin E蛋白的表达，探讨FBXW10和Cyclin E蛋白的临床意义以及两者与肾癌发生、发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集安徽医科大学第二附属医院2016年1月—2017年12月手术切除后病理为肾透明细胞癌的组织标本60例，其中20例取距肿瘤边缘2 cm以上的癌旁肾组织(病理证实无肿瘤细胞浸润，无明显炎等病变)作为癌旁正常对照，男性37人，女性23人。平均年龄58.4(30～82)岁。组织学分级Ⅰ～Ⅳ级分别为11、36、9、4例，分别占总人数的比例为18.3%、60.0%、15.0%、6.7%。诊断时即有远处转移的12例。所有患者经我院病理科切片检查确诊为肾透明细胞癌，术前均未接受化疗或放疗治疗，患者资料完整。由同一位医师查阅病历资料，收集资料包括性别、年龄、肿瘤分期、是否远处转移以及肾癌细胞组织学分级等。本研究经我院医学伦理委员会审批，所有资料获取及发表均经患者本人或家属同意，并签署知情同意书。

1.2 试剂、染色方法

FBXW10鼠抗单克隆抗体及Cyclin E兔抗单克隆抗体为美国Santa Cruz公司生产，通用型DAB显色试剂盒S以及P试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。所有组织标本于术中离体30 min内取材，经4%甲醛溶液固定，常规制作石蜡包埋，切片厚度4 μm，均采用免疫组化SP法染色，FBXW10和Cyclin E一抗均稀释80倍后使用。以PBS代替一抗作为阴性对照，具体步骤严格按操作说明进行操作。

1.3 免疫组化结果判定

所有免疫组化结果均由两位未参与研究的病理科医生分别独立观察，当结果不一致时，则由两人商议做出决定。FBXW10与Cyclin E蛋白的阳性表达可定位于细胞浆或细胞核，若细胞核或胞浆出现棕黄色颗粒染色则判定为表达阳性。每例标本在400倍光镜下选择5个视野，每个视野计数200个细胞，该标本的阳性细胞比率为每个视野内阳性细胞百分数均数。FBXW10阴性定义为阳性细胞百分数<20%，≥20%定义为阳性；Cyclin E阳性细胞百分数<5%为阴性，≥5%为阳性。

1.4 统计学处理

运用SPSS 19.0软件处理数据，率的比较采用卡方检验，肾癌组织中FBXW10、Cyclin E表达的关联性采用卡方检验计算列联系数，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FBXW10蛋白与Cyclin E蛋白表达

FBXW10蛋白在肾透明细胞癌及其癌旁正常组织中的阳性表达率分别是40.0%和70.0%，Cyclin E蛋白的阳性表达率分别是55.0%和25.0%，两种蛋白在肾癌及其癌旁正常组织中的阳性表达差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。FBXW10蛋白与Cyclin E蛋白的细胞浆和细胞核棕黄色颗粒染色为阳性(图1-2)。

图1 肾透明细胞癌组织及癌旁正常组织中FBXW10蛋白的表达(400×)Figure 1 Expression of FBXW10 in the renal cancer and adjacent normal tissues(400×)Note：A.Expression of FBXW10 in renal clear cell carcinoma tissues；B.Expression of FBXW10 in adjacent normal tissues.

图2 肾透明细胞癌组织及癌旁正常组织中Cyclin E蛋白的表达(400×)Figure 2 Expression of cyclin E in renal clear cell carcinoma and adjacent normal tissues(400×)Note：A.Expression of cyclin E in renal clear cell carcinoma tissue；B.Expression of cyclin E in adjacent normal tissues.

表1 肾透明细胞癌组织及癌旁正常组织中FBXW10 和Cyclin E 蛋白的表达阳性表达例数

2.2 肾透明细胞癌中FBXW10和Cyclin E蛋白的表达与临床病理特征的关系

肾透明细胞癌组织中FBXW10蛋白的表达率与肾癌组织学分级(P=0.041)和远处转移(P=0.030)相关，而与性别、年龄、肿瘤分期无关(P>0.05)。Cyclin E表达与肿瘤分期(P=0.005)、远处转移(P=0.011)、肾癌组织学分级(P=0.035)相关，而与性别、年龄无关(P>0.05)(表2)。

表2 肾透明细胞癌组织及癌旁正常组织中FBXW10和Cyclin E蛋白的表达与临床病理特征关系

2.3 肾透明细胞癌组织中FBXW10和Cyclin E蛋白表达的关联性

肾透明细胞癌组织中FBXW10蛋白呈低表达、Cyclin E蛋白高表达，两者存在相关性(r=0.533，P<0.001)(表3)。

表3 肾透明细胞癌组织中FBXW10和Cyclin E蛋白的表达的关联性

Table 3 Correlation between the expression of fbxw10 and cyclin E proteins in renal clear cell carcinoma tissues

FBXW10Cyclin EPositiveNegativeTotalPositive42024Negative29736Total332760

3 讨论

肾细胞癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率逐渐升高，且发病年龄逐渐年轻化，已成为影响国民健康的主要威胁之一。肾细胞癌中最常见的类型为透明细胞癌，约占全部病理类型的85%。肾癌恶性度较高，25%的肾癌病例就诊时已为晚期病变，我国每年因肾癌死亡的人数高达到2万[1-2]。晚期肾癌对常规放、化疗不敏感，即使靶向治疗也疗效有限，且价格极为昂贵，给家庭、社会带来沉重经济负担[7]。肾癌治疗的一大瓶颈是其发生、发展机制尚不清楚，缺乏明确的治疗靶点。探明肾癌的发生、发展的其他机制是目前临床上迫切需要解决的医学热点之一，这也是早期诊断并寻找新的、有效的肾癌靶向治疗的主要切入点。

泛素是一类分子量为9 KD的蛋白质，泛素化是指泛素分子在一系列特殊酶的作用下，将细胞内的蛋白质进行分类，从中选出靶蛋白分子，并对靶蛋白特异性修饰或降解的过程。泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3催化的一系列连续反应。SCF类E3复合体是泛素连接酶E3中的一种，由支架蛋白(Cul1)、环指蛋白(Rbx1)、衔接蛋白(Skp1)和一个F-box蛋白组成，其中F-box蛋白类决定底物特异性[8-9]。

最近鉴定出了一种新颖的WD-40重复结构域蛋白家族，即F-box蛋白家族，其靶蛋白通过泛素连接酶E3的一系列作用被泛素化而降解。在这个家族中研究较多的是FBXW7，其含有7个WD-40重复结构域，具有抑癌基因的潜能。FBXW7处于蛋白网络调控的中心位置，在细胞分裂、分化、凋亡、侵袭以及肿瘤转移、肿瘤耐药等多个方面发挥重要功能。在细胞生物学中具有重要作用的cyclin E、c-myc、c-jun和Notch等蛋白都是通过FBXW7介导的蛋白酶体途径进行降解[3，10]。FBXW7可通过促进体内KLF5泛素化降解从而抑制脂类代谢和细胞增殖，进而影响肿瘤发展；FBXW7可以通过促进Mcl-1降解，加快细胞凋亡；FBXW7可以通过泛素化蛋白酶作用促使DAB2IP降解；在肠道内稳态及癌症发生中，Usp28通过去泛素化作用，抑制FBXW7对c-Myc、Jun等蛋白的泛素化降解进而促进肿瘤发生。Iwatuki等发现FBXW7在恶性肿瘤组织中的表达较癌旁组织明显降低[11]。Du等研究发现恶性程度高的食道癌组织中FBXW7低表达或表达缺失，FBXW7表达水平与肿瘤组织的恶性程度及患者的生存率具有相关性[12]。FBXW7靶向降解cyclin E与淋巴肿瘤和胰腺癌的发生密切相关[13]。

FBXW10基因位于人染色体17p11.2，其表达产物FBXW10结构中包含三个保守的蛋白质相互作用的结构域：F-box、WD重复序列和D结构域。F-box基序由N端的40个氨基酸组成，该基序和SKPl直接结合，发挥泛素连接酶活性，10个WD40重复序列，介导FBXW10与靶底物的结合；D结构域介导FBXW10的二聚化。FBXW10与FBXW7虽为同一家族蛋白，具有相似的结构域，但两个基因在染色体的定位是完全不同的，两个蛋白的功能可能不全相同。回顾文献，目前关于FBXW10的研究较少，仅知道它是FBXW蛋白家族中的另一个蛋白，是一种泛素-蛋白酶连接蛋白，参与核纤层蛋白诱导的某些HP1亚型的蛋白酶体降解，其在泛素化降解中其功能可能与FBXW7相似，FBXW10的功能有待深入研究[14-15]。课题组前期研究显示肾癌组织和肾癌细胞株中FBXW10基因启动子区CpG岛高度甲基化。FBXW10在肿瘤组织启动子平均甲基化率与Fuhrman分级呈正相关，初步说明FBXW10为抑癌基因，其启动子高甲基化是其表达下调的可能机制[5]。本研究显示FBXW10在肾透明细胞癌组织中低表达，肾透明细胞癌及其癌旁正常组织中的阳性表达率分别是40.0%和70.0%，阳性表达率差异有统计学意义。肾癌细胞组织学分级越差，或发生远处转移的患者，其癌组织中FBXW10表达越低。进一步验证了FBXW10为抑癌基因，其表达下调可促进恶性肿瘤的发生、发展与转移。通过检测FBXW10基因甲基化水平或检测血液中循环肿瘤细胞、血清中FBXW10表达产物等方法，FBXW10今后可能成为早期诊断肾癌的一种生物标志物，并可辅助判断肿瘤的恶性程度及预后，为肾癌诊断与治疗带来帮助。

细胞周期蛋白E是调控细胞周期进程的细胞周期蛋白家族中的一员。人类Cyclin E基因定位于染色体19q12-q13，编码由395个氨基酸组成的分子量为45 KD的蛋白，通常称为周期蛋白盒。Cyclin E在细胞周期中G1/S、G2/M和有丝分裂中后期交界点这三个关键调控点起着对细胞周期进行精密调节的重要作用。肿瘤的发生常与这些调控点的异常调节密切相关。Cyclin E被认定为原癌基因，Cyclin E的增高将促进肿瘤细胞的增殖，与肿瘤的侵袭性存在密切关系。Cyclin E在卵巢癌、宫颈癌、乳癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、大肠癌等多种恶性肿瘤中均呈过度表达，且与肿瘤的恶性程度及预后相关[6，16]。Cyclin E在肾癌中的研究不多，有学者采用免疫印迹法发现其在肾癌组织的阳性表达率为65%，Cyclin E的表达阳性率明显高于癌周正常肾组织，并有部分病例出现强阳性，Cyclin E的高表达同肾癌分级、分期紧密相关[17-18]。本研究显示Cyclin E在肾透明细胞癌组织中高表达，癌旁正常肾组织中低表达，肾肿瘤病理分期越差、细胞学分级越高或伴有转移患者，其癌组织中Cyclin E表达越高，这与既往研究结果一致，进一步表明Cyclin E为癌基因，Cyclin E可能影响肾癌的生物学行为，其高表达可引起肿瘤细胞的增殖，与肾癌的发生、浸润和转移侵袭相关。

本文分析显示FBXW10与Cyclin E蛋白在肾透明细胞癌组织中表达存在相关性。我们推测FBXW10可能通过泛素化降解Cyclin E诱导肾癌细胞凋亡和生长阻滞。肾癌中FBXW10低表达可能导致Cyclin E蛋白的高表达或蓄积，从而促进癌细胞的异常增殖，进而导致肾癌的发生、发展与转移。

综上所述，FBXW10与Cyclin E的表达与肾癌的发生、发展及转移密切相关，检测结肾癌中FBXW10与Cyclin E的表达可以预测肿瘤恶性程度。研究FBXW10与肾癌细胞之间的联系和分子机制很可能揭示一种肾癌发生发展的新途径，为肾癌的诊断和分子靶向治疗提供新的方向。