基于宏基因组学分析气调包装中华鳖贮藏期间菌相变化

过雯婷 陈师师 何中央 薛 静，2 戴志远，2*

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310012 3 浙江省水产技术推广总站 杭州311100）

中华鳖，又名水甲鱼、团鱼，肉质鲜美，营养丰富，高蛋白、低脂肪[1]，其裙边还含有丰富的胶原蛋白[2]，具有较大的的食用、药用价值，全国各地已广泛开展人工繁育及养殖，以满足日益增长的市场需求。传统观念下，消费者更倾向于保活的鳖类产品，活体运输成本高，长途运输过程中车辆颠簸、气温波动等环境因素增大了保活难度，个体死亡腐败也会污染其它健康个体。采用独立包装，同时配合有效保鲜方法的包装中华鳖产品具有较大的开发潜力和较高的市场价值。气调包装是食品保鲜常用的方法之一，较之其它保鲜方法，该类产品通常保质期较长，品质稳定可控，更贴合现代市场对商品的标准化要求。

微生物因素对水产品的腐败变质起主要作用[3]，研究气调包装中华鳖贮藏期间菌相变化，对中华鳖贮藏保鲜技术的发展有着积极意义。现今，高通量技术蓬勃发展，宏基因组学分析是研究环境微生物群落丰度、多样性变化最有效的方法，广泛应用于农学[4]、环境[5]、医学[6-7]等学科的研究，在食品科学领域也逐渐受到关注。曹荣等[8]应用高通量测序方法分析牡蛎微生物群落；魏泉增等[9]应用宏基因组技术鉴定酱油曲真菌优势菌株；聂志强等[10]采用宏基因组学技术分析传统食醋发酵过程微生物多样性。目前，宏基因组学法在中华鳖贮藏保鲜领域的应用鲜有报道。本文采用宏基因组学法研究气调包装中华鳖在4 ℃贮藏过程中的菌相变化，旨在为中华鳖的贮藏保鲜提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料采集及预处理

新鲜中华鳖，购于天福科技有限公司，质量约700 g/只。鳖颈部放血致死，去除内脏和脂肪块，装入KPET/PE 包装袋中。根据前期研究结果确定气调包装气体比例为50%CO2/50%N2，包装气体体积与鳖质量体积比为3 mL ∶1 g。将样品放在（4±1）℃冷藏箱中贮藏，于贮藏中期和末期取样，新鲜原料直接留样。

1.2 试验材料、仪器与设备

1.2.1 材料 限制性内切酶，宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖凝胶（分析纯），西班牙进口分装；Taq DNA 聚合酶，TakaRa 宝成试剂有限公司；1 000 bp Marker，TakaRa 宝成试剂有限公司；EDTA （分析纯），无锡市展望化工试剂有限公司；RNA 酶A，美国Sigma 公司；细菌基因组DNA 小量提取试剂盒，北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.2.2 仪器、设备 凝胶电泳仪，美国BIO-RAD公司；DZQ-F 气体自动混合机，张家港德顺机械有限责任公司；DQB-360W 多功能气调包装机，张家港德顺机械有限责任公司；Fresco21 微量离心机，美国Thermo 公司；Wide Mini-SubRCell GT水平电泳槽，美国BIO-RAD 公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；LRH-150-S 恒温恒湿培养箱，广东省医疗器械厂。

1.3 宏基因组DNA 提取

参考ERMA D[11]的方法，适当修改后提取宏基因组DNA。称取样品5.0 g 于盛有50 mL 无菌生理盐水的锥形瓶中，37 ℃恒温摇床振摇15 min（200 r/min），4 层无菌纱布过滤，收集滤液，离心（1 000 r/min，5 min，4 ℃），收集上清液，再次离心（8 500 r/min，5 min，4 ℃），弃上清液，取沉淀。使用细菌基因组DNA 小量提取试剂盒处理所得沉淀，具体步骤参考说明书。提取的总DNA 采用紫外分光光度计检测浓度及纯度。根据浓度检测结果，采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 样品的完整性（电压120 V，电泳时间20 min）。

1.4 16S rDNA V4 区PCR 扩增及Illumina 测序

从3 个样品提取的基因组DNA 扩增V4 区片段，PCR 扩增引物为520F：5-AYTGGGYDTAAAGNG-3 和802R：5-TACNVGGGTATCTAATCC-3。

PCR 反应体系：25 μL 样品原液，8.75 μL 灭菌超纯水，5.0 μL Q5 反应缓冲 （5×），5.0 μL Q5 GC 高效增强剂（5×），2.0 μL dNTP（2.5 mmol/L），2.0 μL 模板（原液），1.0 μL 引物F（10 μmol/L），1.0 μL 引物R（10 μmol/L），0.25 μL Q5 聚合酶（5 U/μL）。

PCR 程序条件：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27 个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR 产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至杭州博讯生物科技有限公司进行Illumina 双末端测序，并以扩增产物为模板进行Illumina Mi-Seq 测序文库的制备。

1.5 数据分析

采用Illumina Mi-Seq 平台进行测序。参考结合ERMA D[11]、Magoc T[12]、Caporaso J G 等[13]的方法，适当改动，对原始数据进行质量过滤，筛选获取有效序列。经过滤，去除嵌合体序列[14-15]，得到优质序列，用于后续分析。优质序列按序列相似度0.97，进行OTU 聚类，再对序列数据库进行比对，获得每个OTU 代表序列的分类学信息。对OTU表利用Qiime[16]生成不同分类水平上（门、纲、目、科、属）的物种丰度表和多样品物种分布图。根据OTU 列表中的各样品物种丰度情况，计算4 种常用的生物Alpha 多样性指数 （Chao 指数、ACE 指数、Shannon 指数、Simpson 指数），反映样品物种多样性程度。

2 结果与分析

2.1 宏基因组DNA 提取及16S rDNA V4 区PCR 扩增

3 组中华鳖样品宏基因组DNA 质量检测结果见表1。3 组中华鳖样品的总基因组DNA 的含量在39.9～82.3 ng/μL，其OD260/280值1.61～1.79，OD260/230值1.00～1.20。这说明获得的总基因组DNA 浓度和纯度较高。

表1 样品宏基因组DNA 质量检测结果Table 1 Quality results of Chinese soft-shelled turtle sample for metagenomic DNA

样品宏基因组DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1，样品条带较为清晰，能够满足后续检测要求。

以520F 和802R 为引物，对提取的样品基因组16S rDNA V4 可变区进行扩增，产物的琼脂糖凝胶电泳图见图2。所有样品均在250 bp 附近显现较清晰的单一目的条带，这说明扩增片段可用于后续试验。

图2 样品微生物基因组16S rDNA V4 可变区扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the PCR amplicons of V4 regions of 16S r DNA genes

2.2 Illumina MiSeq 平台测序原始数据处理及质量评估

采用Illumina MiSeq 平台进行测序和质量过滤，再根据Index 信息筛选，获取通过质量过滤并与Index 完全匹配的有效序列。去除嵌合体序列后得到优质序列，样品序列数统计见表2。3 个样品优质序列数在65 362～125 058 之间，长度分布在223～235 之间，满足分析要求。

表2 样品序列数统计表Table 2 Sequence number data of different samples

2.3 OTUs 分析

OTU（Operational Taxonomic Units，操作分类单元）[17]是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于分析，人为给某一个分类单元（品系，属，种、分组等）设置的同一标志。将序列按照一定的相似性分归为许多分类单元，即OTU。OTU 聚类分析，选取每个类中最长的序列为代表序列，对比序列数据库，获得每个OTU 代表序列的分类学信息，统计得到样品在不同分类水平下的OUT 数。由表3可知，3 个样品在属水平的OTU 数在941～1 046 之间。

2.4 Alpha 多样性分析

Alpha 多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性。多样性指数是反映物种丰富度和均匀度的综合指标，包括Ace 指数、Chao 指数、Simpson 指数和Shannon 指数。群落丰富度（Community richness）的指数，包括Chao 指数和Ace 指数。Chao 指数由Chao[18]最早提出，在生态学中常用来估计物种总数。Ace 指数用来估计群落OTU数目的指数。Chao 指数或Ace 指数越大，群落丰富度越高。群落多样性（Community diversity）的指数包括Shannon 指数和Simpson 指数。Shannon 指数[19]越大，群落多样性越高。Simpson 指数由Edward Hugh Simpson[20]提出，其值越大，群落多样性越低。3 组样品Alpha 多样性指数见表4。

由表4可知，根据Ace 指数和Chao 指数，在整个贮藏过程中，气调包装样品的群落丰富度逐渐上升。根据Shannon 指数和Simpson 指数，气调包装样品贮藏过程中物种多样性中期前逐渐上升，之后明显下降。气调包装对好氧微生物有明显的抑制作用，其所占比例在贮藏中、后期逐渐降低；而一些对气调环境适应良好的微生物占比逐渐升高，并取得显著优势，这些微生物是导致气调包装中华鳖腐败的主要原因。

表3 不同分类水平下的OTU 统计表Table 3 Statistical analysis of OTUs

表4 不同样品的Alpha 多样性Table 4 Alpha diversity metrics of different samples

2.5 中华鳖贮藏过程中细菌组成在门水平的变化

气调包装中华鳖不同贮藏阶段微生物在属水平上的组成和数量变化统计结果见图3。中华鳖气调包装微生物主要为蛋白菌门、拟杆菌门和厚壁菌门。整个贮藏过程中，蛋白菌门总体呈先下降后上升趋势；拟杆菌门呈先上升后下降趋势；厚壁菌门虽先下降后上升，但最终与原料占比相近。

新鲜原料中蛋白菌门占42.09%，其次为拟杆菌门27.88%、厚壁菌门19.97%。中期样品占比超过1%的微生物种类最多，其中拟杆菌门40.84%，蛋白菌门29.19%，厚壁菌门、放线菌门、酸酐菌门、浮霉菌门分别占9.91%，5.83%，2.66%，2.46%。末期样品中蛋白菌门占比大幅上升至59.01%，拟杆菌门降至12.59%，而厚壁菌门升至19.61%。

2.6 中华鳖贮藏过程细菌组成在属水平上的变化

微生物是水产品腐败的主要因素，然而只有少数几种作为特定腐败菌（SSOs）的微生物会导致水产品腐败、散发腥臭味[26]。一般这些特定腐败菌在新制作的水产品中数量和所占百分比都很低[26]，而后随着pH、水分活度、气体环境、温度等环境条件的变化，微生物生长繁殖速度、代谢方式等发生变化，成为数量、组成上的优势菌，从而导致水产品腐败变质。从中华鳖新鲜原料共检出498 个属的微生物，气调包装中期604 个，气调包装末期591 个。气调包装中华鳖不同贮藏阶段微生物在属水平上的组成和数量变化统计结果见图4。

图3 新鲜原料和气调中、末期样品在属门水平上的菌相分布Fig.3 Microflora distribution of modified atmosphere packaging samples and fresh materials at phylum level

图4 不同贮藏时期样品在属水平上的菌相分布Fig.4 Microflora distribution of samples at different storage period at genus level

结果表明：新鲜原料中优势微生物为细菌富集培养克隆AOM-SR-B4 属 （bacterium enrichment culture clone AOM-SR-B4）、假单胞菌属（Pseudomonas）、脱硫叶菌属（Desulfobulbus）和黄杆菌属（Flavobacterium），所占比例分别为12.19%，11.36%，10.28%，9.82%。其中，假单胞菌属产生挥发性物质，如醛、酮、酯和硫化物，散发出特有的浓郁氨臭味[21-23]，是一种常见的水产品腐败菌。其次，魏斯氏菌属（Weissella）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）、薄层菌属 （Hymenobacter）、硫杆菌属（Thiobacillus），分别占4.55%，3.30%，2.97%，2.63%。

气调包装中华鳖贮藏中期占比最高的菌属为薄层菌属（Hymenobacter）（11.33%），其次是黄杆菌属 （Flavobacterium）（8.89%） 和假单胞菌属（Pseudomonas）（8.25%）。中期样品与新鲜原料相比，黄杆菌属（Flavobacterium）（原料9.82%）和假单胞菌属（Pseudomonas）（原料11.36%）百分比变化幅度不大，而薄层菌属（Hymenobacter）在贮藏前期增长明显。随着贮藏时间的延长，以上3 个菌属占比均有所下降，至贮藏末期分别为3.60%，2.17%，4.01%。

气调包装末期的优势菌属为希瓦氏菌属（Shewanella）（29.68%），其后依次为乳酸菌属（Lactobacillus）（15.49%）和紫杆菌属（Iodobacter）（11.9%）。其中希瓦氏菌属在原料和中期占比极低，而在贮藏后期大量生长繁殖。希瓦氏菌属以研究水产品腐败数十年的科学家James M Shewan命名[24]，是一种常见的导致水产品劣化的腐败微生物。希瓦氏菌属代谢会产生H2S，并能够将TMAO 分解成TMA，而TMA 是水产品腥臭味产生的主要原因[25-26]。研究表明[26]，TMAO 的分解对水产品腐败的影响在缺乏氧气的条件下更加明显，这与气调包装样品随着希瓦氏菌属的大量繁殖而进入贮藏末期相符。希瓦氏菌属（Shewanella）和假单胞菌属（Pseudomonas）是水产品常见的特定腐败菌（SSOs）[27]，气调包装虽有效抑制了假单胞菌属（Pseudomonas），但不能很好地抑制希瓦氏菌属（Shewanella），这与Dainty 等研究结果相一致[28]。

根据前期研究结果：新鲜中华鳖肌肉的初始pH6.3，气调包装在贮藏18 d 后pH 上升至6.77。希瓦氏菌属为pH 敏感菌，适宜在pH＞6 的高pH环境下生存[27]，这是导致希瓦氏菌属在贮藏中后期大量繁殖的因素之一。假单胞菌属为严格需氧菌，在缺乏氧气供应的气调环境下生长繁殖受到明显抑制，而希瓦氏菌属属兼性厌氧菌，气调环境对其生长繁殖没有明显的抑制作用。黄杆菌属（Flavobacterium）广泛存在于淡水、海水中，在水产品中很常见，与假单胞菌属（Pseudomonas）相同，黄杆菌属（Flavobacterium）也是一种严格厌氧菌，由图4可知，气调包装对黄杆菌属微生物也有较强的抑制作用。乳酸菌（Lactobacillus，15.49%）为兼性厌氧菌，低氧含量或厌氧条件有利于其生长繁殖，在整个贮藏过程中逐渐成为优势菌之一。此外，新鲜原料中占比较大的细菌富集培养克隆AOM-SR-B4 属和脱硫叶菌属（Desulfobulbus），在4 ℃气调包装贮藏条件下也均得到有效的抑制。

3 结论

采用宏基因组学法分析气调包装中华鳖在4℃贮藏期间的微生物群落组成及丰度。在整个贮藏过程中，气调包装样品的群落丰富度逐渐上升，物种多样性呈先上升后下降趋势。气调包装末期的优势菌属为希瓦氏菌属 （Shewanella）（29.68%）和乳酸菌（Lactobacillus）15.49%，其在贮藏初期处于劣势状态，因其对气调包装环境有很强的适应能力，故得以快速生长繁殖，逐渐成长为优势菌。气调包装能有效抑制假单胞菌属（Pseudomonas）、黄杆菌属（Flavobacterium）等水产品中常见的腐败微生物，从而维持产品新鲜品质，是中华鳖包装贮藏的优良选择。