二氢杨梅素对乳腺癌模型小鼠的抑瘤作用及其对小鼠肝、肾毒性的影响

张明亮，刘先富，陈 晨，唐经纬，张晓静，许 波

(蚌埠医学院第一附属医院，安徽 蚌埠 233002)

黄酮类化合物具有抗菌消炎、护肝利胆、保护心肌、抗肿瘤等多种药用功效。其药物制剂如，黄芪、银杏、水飞蓟等疗效确切，副作用小，已在临床广泛应用。二氢杨梅素作为黄酮类化合物的重要成员之一，大量文献已证实其具有抗菌消炎、增强免疫功能、减轻放化疗毒副作用的功效[1-2]。近年来发现二氢杨梅素还具有一定的抗肿瘤作用，它可以通过调节抑癌基因PTEN蛋白的表达，抑制肿瘤细胞的增殖和代谢[3]。我们的前期细胞实验研究发现，二氢杨梅素可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路，在体外抑制乳腺癌细胞的增殖[4]。本研究进一步观察了二氢杨梅素在荷瘤动物体内的抑瘤效果。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人乳腺癌MCF-7细胞株(上海奥陆生物科技有限公司)。

1.1.2 试验动物 实验用小鼠为SPF级，BALB/c裸鼠，雌性，15只，鼠龄为(45.0±1.3)d，体重(20.0±0.8)g，均由蚌埠医学院动物实验中心提供，生产许可证号编号：SYXK(皖)2010-012。蚌埠医学院科研中心代为饲养与保管，动物饲料及饮水均经过紫外线灭菌处理。

1.1.3 主要试验仪器和试剂 PUS-2018半自动生化分析仪(北京普朗医疗)，离心机(日本Hema)，TDX血药浓度检测仪(美国雅培)，二氢杨梅素(南京景竹)。

1.2 方法

1.2.1 SKBR3裸鼠乳腺癌模型建立 根据相关文献记载[5]，将稳定生长传代的MCF-7细胞株浓度调整为1×104/μL，每日取50μL细胞悬液注射于裸鼠右腋下皮下组织，待肉眼可见成瘤后，用卡尺测量移植瘤长、短径，并记录。当瘤体生长至100mm3时，停止接种，小鼠一般情况良好，为建模成功。接种后第14天，从中选取已成瘤小鼠12只，瘤体体积在100mm3以上，高出身体皮肤表面，活动度差，质地硬，血管丰富。随机编号，分2组，每组6只，分别对照组与实验组。

1.2.2 给药方法 对照组每日给予足量饵料外同时给予1mL生理盐水(安慰剂)灌胃，实验组每日给足量饵料外同时给予含有二氢杨梅素与生理盐水混合的半流质1mL灌胃。二氢杨梅素最终确定实验给药剂量方法如下：称取一定量二氢杨梅素粉剂，与1mL生理盐水混合成半流质，从5mg/g(小鼠体重，下同)初始剂量开始，每日逐步增加二氢杨梅素剂量10mg/g、15mg/g、20mg/g、25mg/g、30mg/g灌胃给药，每日1次，灌胃后6h测定血药浓度和心(LDH、CK)、肝(ALT、AST)、肾(Cr)功能，至出现血清LDH、CK、ALT、AST、Cr任何一项指标异常，退回到上一剂量，并作为实验维持给药剂量，最终确定每日实验给药剂量为二氢杨梅素25mg/g小鼠体重。

1.4 统计学处理应用SPSS 20.0软件，计量资料以“均数±标准差”表示，组间比较采用t检验、方差分析，GraphPad Prism 7.0作图软件，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验裸鼠一般情况受试裸鼠饮食、饮水、排便、一般活动、毛色外观均无异常。两组小鼠均每日定时定量喂食水，在治疗过程中无小鼠发生死亡。

2.2 二氢杨梅素耐受剂量及血药浓度从25mg/g递增到30mg/g时，其中1只小鼠的肝功能出现轻度异常，ALT 38.8U/L(正常值4～30U/L)，且进食量明显下降，原因可能与二氢杨梅对胃肠道刺激反应有关。之后维持在25mg/g·d灌胃，小鼠肝肾功能血清指标均可维持在较为平稳水平，血药浓度(25.2±2.1)μg/mL。见图1。

图1 不同给药浓度对应血药浓度变化

2.3 小鼠荷瘤体积的变化对照组肿瘤生长快速，体积逐渐增大，从喂养第7天，荷瘤体积已增大到接近初始的3倍，第14天时，平均肿瘤体积达(953±105)mm3。应用二氢杨梅素治疗组，肿瘤体积增加速度显著放缓，实验结束时，该组小鼠荷瘤体积平均值为(467±65)mm3。数据经方差分析统计学处理，实验组相比对照组可显著抑制肿瘤的生长速度，差异具有显著性(P<0.05)。见表1。

表1 不同时间段肿瘤体积变化(mm3)

2.4 小鼠移植瘤重量变化及抑瘤率情况对照组及实验组同时处理14d后，处死小鼠，仔细剥取瘤体，拍照并称重。经t检验分析处理，实验组瘤体重量显著小于对照组(P<0.05)，实验组抑瘤率达43.35%，见表2。

表2 不同治疗方法对小鼠移植瘤重量的影响(g)

注：*P<0.05。

2.5 小鼠血清LDH、CK、ALT、AST、Cr水平的差异实验组及对照组不同方式处理14d后，两组小鼠血清LDH、CK、ALT、AST、Cr指标水平变化情况如下表，实验数据经t检验分析统计学处理，两组均无显著差异(P>0.05),见表3。

表3 二氢杨梅素对小鼠血清LDH、CK、ALT、AST、Cr水平的影响

3 讨论

乳腺癌是当今世界严重威胁妇女生命安全的常见恶性肿瘤。最新的2018年经国家癌症中心数据统计，乳腺癌已跃居女性恶性肿瘤发病率的第一位。每年全球大约有140万新增病例，约45万人死于乳腺癌。随着科技的发展，新的抗乳腺癌药物不断上市，但仍然不能满足乳腺癌患者对癌症治疗的渴求，当前从天然植物中寻找抗肿瘤的有效成分是肿瘤药物研究的热点之一。纯天然成分二氢杨梅素是从藤茶类植物中提取而成，隶属于黄酮类化合物，具备抗氧化、抗血栓、护肝、消炎等多种功效。最近研究发现，二氢杨梅素还具备抗肿瘤的功效，能够抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡[6-7]。联合化疗药物应用时，可以增强化疗药物抗肿瘤作用，并能够减轻化疗造成的骨髓、肝、肾损害[8]。我们的前期细胞研究发现，二氢杨梅素可以通过调节PI3K/AKT信号通路，抑制乳腺癌SKBR3细胞的增殖，促进其凋亡[4]。国内也有学者通过研究发现二氢杨梅素可以调节STAT3/Bcl-2信号通路，起到抗肿瘤作用[9]。

在本研究中，我们通过注射MCF-7乳腺细胞株于裸鼠腋下，成功建立乳腺癌的小鼠模型，并观察二氢杨梅素在活体体内的抗肿瘤效果。通过口服给药这种相对安全的给药方法，按药物浓度梯度逐日加量给药，初步确定药物在实验动物体内的最大安全剂量，我们发现按25mg/g·d二氢杨梅素剂量灌胃，可将小鼠体内血药浓度维持在(25.2±2.1)μg/mL。维持在此剂量下，在饲养14d后，观察对肿瘤的抑制效果。第14天时，对照组平均肿瘤体积达(953±105)mm3，超过初始体积达9倍，质量达(2.63±0.55)g。而实验组肿瘤体积仅(467±65)mm3，质量为(1.49±0.47)g。两组肿瘤在体积与质量上均有显著的统计学差异，治疗2周后的抑瘤率达43.35%。而代表心肌功能的重要指标血清乳酸脱氢酶LDH、肌酸激酶CK；代表肝功能的重要指标血清谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST，代表肾功能的重要指标血清肌酐Cr，在两组小鼠中均无显著差异。表明通过灌胃途径给药，二氢杨梅素的常规毒副作用不明显。

本文仅通过初步的研究，证实了二氢杨梅素在实验动物体内的抗肿瘤效果，并且无明显的毒副作用。但是，由于实验动物的数量较少，给药时间较短(仅2周)，加之灌胃给药途径虽然操作简单，但药物利用度在不同小鼠之间吸收度可能不同，以及手实验者操作方法的影响，其给药的精确度不如静脉给药，实验数据有待更大样本量的佐证。此外通过这种方法单药二氢杨梅素给药，可明显减缓了肿瘤的生长速度，那么联合应用化疗或靶向药物能否进一步控制肿瘤的生长，二氢杨梅素通过何种途径在体内起到抗肿瘤作用，均有待进一步研究。