基于TCGA数据库分析NMB基因在结肠腺癌的诊断和预后价值*

朱丽晨，阮国添，马辉，廖锡文，廖存，闫岭，龚艺贞△

1 广西医科大学基础医学院 广西南宁 530021

2 广西医科大学第一附属医院结直肠肛门外科 广西南宁 530021

3 广西医科大学第一附属医院肝胆外科 广西南宁 530021

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一［1］。根据2018年全球癌症数据报道，全球2018年发生的新发癌症病例超过180万例，死亡人数为881 000例，近十年来中国的结直肠癌的发生率和死亡率均有上升趋势［2］。结肠腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）是结直肠癌最常见的病理类型之一（约占95%）［3］。然而目前现有的结肠腺癌的治疗手段（包括手术和化疗等综合治疗）仍然不能达到令人满意的效果，结肠腺癌的五年生存率依然不容乐观［4］。大部分患者发现和初诊为结肠腺癌时已处于癌症晚期，因此，现阶段的医疗诊治过程中晚就诊、缺乏可靠的生物标志物和不精准的治疗靶点已成为治疗结肠腺癌的主要障碍［5］，而早期诊断和治疗对于改善患者的预后和生活质量至关重要。本研究从TCGA数据库下载相关数据，运用生物信息学技术分析和预测NMB基因对结肠腺癌的潜在的诊断和预后应用价值，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 数据来源

从The Cancer Genome Atlas（TCGA：https://tcga-data.nci.nih.gov/，访问时间：2018年12月29日)［6-7］公共数据库下载有关神经调节肽B基因（neuromedin B，NMB）的mRNA测序数据集及与之相一致的患者临床参数资料。根据NMB基因表达量的中位数进行分组，分为高表达组和低表达组，然后通过整合的数据进行相关的诊断性和预后分析研究，另外我们还从公共网络平台Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA：http://gepia.cancerpku.cn/index.html，访问时间：2019年6月29日）［8-9］下载与NMB基因相关的表达量箱式图和TNM分期小提琴图。

1.2 统计学方法

选用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理，t检验用于分析癌组织和癌旁正常组织中NMB基因的差异表达；单因素Kaplan-Meier生存分析用于获得单因素P值（Log-rankP），单因素COX回归模型用于获得单因素风险比（Hazard Ratio，HR）及95%置信区间 （95%confidence interval，95%CI），单因素生存分析有统计学意义的临床参数进行校正后纳入多因素COX回归模型用于分析临床参数与COAD生存预后的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。通过GraphPad Prism 8.0.1软件获得癌组织和癌旁正常组织中NMB基因差异表达小提琴图、诊断性ROC曲线图和生存曲线图。

2 结果

2.1 NMB基因在癌组织及癌旁正常组织的表达

从TCGA公共数据库收集了456例COAD患者（其中包括480例癌组织和41例癌旁正常组织）的NMB基因的mRNA测序数据和与之相一致的临床资料，然后将两者进行整合，排除重复项和生存时间为0的患者，最后纳入438例癌组织样本和41例癌旁正常组织样本，癌组织中mRNA表达量为（259.216±177.439），高于癌旁正常组织中的mRNA表达量（64.336±22.301），差异有统计学意义（P＜0001），见图1A。然后从GEPIA公共网络平台下载了NMB基因的表达量的箱式图（图1B）,由图可见，NMB基因在癌组织中的中位表达量高于癌旁正常组织，与本文数据分析趋势相一致，提示NMB基因在癌组织异常高表达。

2.2 NMB基因的诊断价值

以NMB基因mRNA在癌旁组织及癌旁正常组织中表达量绘制诊断性ROC曲线，结果表明NMB基因在结肠腺癌中有高诊断价值（P＜0.0001,AUC=0.976,95%CI:0.963～0.990）。见图1C。

2.3 NMB基因表达与COAD总生存时间之间的关系

将临床参数年龄，性别和TNM分期进行单因素Kaplan-Meier生存分析，结果提示年龄和性别与COAD患者的总生存时间（overall suvival）无关（P＞0.05），而TNM分期与COAD患者的总生存时间有关（P＜0.01）。校正TNM分期后进行多因素Cox回归分析结果表明NMB基因表达与COAD患者的总生存时间差异有统计学意义（AdjustedP=0.007，AdjustedHR=1.778，95%CI:1.167～2.710），见表 1。根据NMB基因表达量的高低绘制的生存曲线结果表明NMB基因低表达的COAD患者总生存时间长于高表达者（P=0.017），见图1D。此外，从GEPIA网站下载在COAD患者NMB基因表达水平的病理分期图，研究NMB基因与TNM分期和预后生存之间的相关性，发现NMB基因表达水平与TNM分期之间无相关性（P＞0.05），见图1E。变量赋值：以生存状态（“生存”赋值0，“死亡”赋值1）为因变量，分别以性别（“男”赋值1，“女”赋值2）、年龄（“≤65岁”赋值1，“＞65岁”赋值2）、TNM分期（“Ⅰ期”赋值1，“Ⅱ期”赋值2，“Ⅲ期”赋值3，“Ⅳ期”赋值4）以及NMB基因表达量（“低表达”赋值1，“高表达”赋值2）为自变量对影响COAD的因素进行单因素和多因素COX回归模型分析。

图1 NMB基因在COAD患者癌组织和癌旁正常组织中表TNM达情况及其在COAD患者癌组织中诊断价值分析、生存分析及与TNM分期的关系

表1 临床参数与COAD患者预后关系的分析结果

3 讨论

癌症的发生和发展是机体内外多种因素调控的，内环境的稳态对于维持细胞正常的代谢和凋亡至关重要［10-11］。结肠腺癌是一种由基因调控的癌症,癌基因的激活和抑癌基因的失活对于癌症的发生发展尤为关键，但是目前与结肠腺癌有关的肿瘤标志物研究比较少。NMB是铃蟾肽样的神经肽家族成员之一，它最早是一种从两栖类动物皮肤分离出来的十四肽［12-13］。NMB可以通过激活它的高亲和力受体，在平滑肌收缩、外分泌与内分泌分泌、炎症和癌症中发挥多种生理和病理功能［14-15］。有研究报道，NMB基因可调节包括肺癌［16］、结肠癌［17］和神经胶质瘤［18］在内的几种癌细胞系中的肿瘤细胞增殖，此外NMB还通过其受体在肿瘤的发生、侵袭和转移过程中发挥着重要作用［19］。

在Matusiak等［17］在基因层面上运用RT-qPCR技术在结肠癌细胞系Caco-2、HT-29细胞，以及正常结肠上皮细胞NCM-460细胞中验证NMB基因的表达，结果发现NMB在肠癌细胞系中的表达量高于正常结肠上皮；此外，免疫组化的结果也显示NMB在肠癌细胞系中的表达量高于正常结肠上皮；且增值试验中发现NMB高表达会促进细胞增殖。Park等［20］从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中下载和分析28例乳腺癌组织和5例正常乳腺组织样本的NMB-R mRNA的表达情况，结果发现前者的表达水平高于后者的；此外，研究还发现NMB-R的抑制剂PD168368可以降低MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，抑制了乳腺癌上皮间转化。类似的结果也可以在非小细胞肺癌中发现［21］。本文的研究发现NMB基因在结肠腺癌组织中的表达高于癌旁正常组织，诊断性ROC曲线表明NMB基因有较高的诊断价值，并且生存析结果发现低表达的NMB基因提示有更好的预后，反之则增加结肠腺癌的死亡风险。

综上所述，NMB在结肠腺癌诊断和预后中有较高的价值，可能是一个潜在的生物学标志物，但是仍需要进一步的体内外研究证实。