龙血竭-羟丙基-β-环糊精包合物的制备及评价

李争艳，陈凌云，罗静，余晓玲

作者单位：1云南中医学院第三附属医院、昆明市中医医院制剂科，云南 昆明 650051；2云南中医学院药学院，云南 昆明 650200

龙血竭为百合科植物剑叶龙血树（Dracaena cochinchinensis（Lour.）S.C.Chen）的含脂树皮和木质部经提取得到的树脂［1］，性味甘、温、咸、平，归心、肝经，具活血散瘀、定痛止血、生肌敛疮的功效。现代研究证实，龙血竭具有显著的抗炎止痛、抗菌、促进表皮修复、活血止血双向调节、调节血管新生、抗氧自由基等药理作用［2-5］。环糊精（Cyclodextrin，CD）具有内腔疏水、外部亲水的特殊结构，能与多种客体分子形成包合物，具有毒副作用小、生物相容性好的优点［6-9］。龙血竭微溶于水，本研究自2017年10月至2018年3月将龙血竭用HP-β-CD包合后，能够使其使用方便、增加溶解度、增强疗效、提高生物利用度，为后续的进一步研究提供便利。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1100高效液相色谱仪（自动进样器、DAD检测器、恒温柱温箱），C18色谱柱（DIKAM柱，4.6 mm×250 mm，5 μm）；电子天平（奥豪斯仪器有限公司，编号：13512747373）；8002型数显恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器厂）；SHZ-DⅢ循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；HJ-4B多头磁力加热搅拌器（常州国华电器有限公司）；差示热分析仪（上海精科天美科学仪器有限公司，编号：592114042011）；DLSB-5L/10低温冷却液循环泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；电子天平（美国双杰兄弟（集团）有限公司，编号：2007063245）；超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，编号：92J044Y）；UV-2450紫外可见分光计（SHIMADZU）。

1.2 试药龙血竭药材由昆明市中医医院提供；龙血素A对照品（购自中国食品药品检定研究院，批号为110736-200934）；龙血素B对照品（购自中国食品药品检定研究院，批号为111558-201006）；羟丙基-β-环糊精（西安德立生物化工有限公司）；包合物（自制）；甲醇（天津市富宇精细化工有限公司）；95%乙醇；乙腈（默克股份两合公司）；冰醋酸（天津市大茂化学试剂厂）；娃哈哈纯净水；硅胶G板（青岛海洋化工厂分厂）。

2 龙血竭包合物包合率的测定

2.1 HPLC测定龙血素A、B的含量

2.1.1色谱条件 色谱柱为DIKAMC18柱（4.6 mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-0.5%冰醋酸（26∶74）；检测波长：275 nm；进样量：10 μL；流速：1 mL/min；柱温：35℃；理论塔板数以龙血素A计算不低于6000。

2.1.2对照品溶液的制备 分别取龙血素A、B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成分别含龙血素A 86.4 μg/mL，龙血素B 41.2 μg/mL的混合溶液。

2.1.3供试品溶液的制备 取龙血竭粉末约0.1 g，精密称定，用甲醇使溶解并定容至25 mL，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.4包合物供试品溶液的制备 取包合物粉末约0.5 g，精密称定，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声20 min，放冷，摇匀，用甲醇定容至刻度，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得包合物供试品溶液。

2.1.5HP-β-CD溶液的制备 取HP-β-CD 0.1 g，精密称定，加甲醇使溶解并定容至25 mL，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得HP-β-CD溶液。

2.1.6专属性考察 按上述方法分别制备对照品溶液、供试品溶液、龙血竭包合物溶液及HP-β-CD溶液，分别精密吸取10 μL上述溶液于色谱仪中，结果如图1所示。

2.1.7线性关系 分别取龙血素A、龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成分别含龙血素A 86.4 μg/mL龙血素B 41.2 μg/mL的混合溶液。分别精密吸取1、2、5、10、15、20、25 μL不同体积上述对照品溶液，注入高效液相色谱仪，测定龙血素A、龙血素B色谱峰积分面积。以龙血素A、龙血素B的进样量为横坐标，其峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（见图2）。结果龙血素A对照品的回归方程为Y＝3 735.9X-6.052 7（R＝0.999 9），表明在0.086 4～2.16–g范围内，龙血素A峰面积与进样量有良好的线性关系；龙血素B对照品的回归方程为Y＝3 131.7X-22.62（R＝0.999 9），表明在0.041 2～1.03 –g范围内，龙血素B峰面积与进样量有良好的线性关系。

2.1.8稳定性试验 取龙血素A、B对照品，包合物供试品适量依法制备对照品溶液和包合物供试品溶液，于第0、4、8、12、16 h，分别吸取10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，结果表明对照品龙血素A、B，包合物龙血素A、B的RSD分别为1.14%、1.88%、1.02%、1.25%，稳定性良好。

2.1.9重复性试验 取同一批次包合物粉末6份，各0.5 g，精密称定，按2.1.4项下包合物供试品制备方法制备样品，按2.1.1项下的色谱条件进行进行龙血素A、B的含量测定，结果表明包合物龙血素A、B的RSD分别为1.24%，1.15%。该方法的重复性良好。

2.1.10准确度试验 取同一已知含量的龙血竭HP-β-CD包合物（含龙血素A 0.528 2 mg/g，龙血素B 0.595 9 mg/g）9份，每份0.5 g，精密称定，精密加入对照品溶液（含龙血素A 86.4 μg/mL，龙血素B 41.2μg/mL）适量（5、10、15 mL三个不同水平，每个水平3份），甲醇定容到25 mL，用高效液相色谱仪测定龙血素A和龙血素B的含量，计算回收率，结果表明回收率符合规定。结果见表1，2。

图1 龙血素A、B对照品、龙血竭药材、龙血竭包合物及羟丙基-β-环糊精的HPLC图谱：1为龙血素A、B对照品；2为龙血竭药材；3为龙血竭包合物；4为羟丙基-β-环糊精

图2 龙血素A、B线性关系

表1 龙血素A加样回收率实验结果

表2 龙血素B加样回收率实验结果

2.2 包合率的测定及计算

2.2.1包合率的测定方法 精密称取龙血竭HP-β-CD包合物0.5 g，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声20 min，放冷，摇匀，取续滤液，按2.1.1项下色谱条件进行含量测定。

2.2.2包合率的计算 精密称取龙血竭粉末0.1 g，置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，取续滤液，按2.1.1项下色谱条件进行含量测定。

3 包合物制备工艺研究

3.1 单因素考察

3.1.1包合温度对包合的影响先精密称取龙血竭粉末，加入95%乙醇使其充分溶解，再精密称取HP-β-CD粉末至100 mL烧杯中，加入40 mL蒸馏水使其充分溶解，龙血竭与HP-β-CD主客分子质量比为1：8，分别在30、40、50、60 ℃不同温度下，边搅拌边向HP-β-CD水溶液中逐滴加入龙血竭乙醇溶液，恒温搅拌3 h，抽滤，滤液水浴蒸干，所得粉末即为龙血竭HP-β-CD包合物。按公式计算包合物的包合率，并进行综合评分。结果见表3。

表3 包合温度对包合的影响

结果：由表3可知，随着温度的升高，包合率有所上升，但50℃到60℃变化并不明显。收率随温度上升而下降，50℃到60℃有较明显下降。综合评分随着包合温度的升高而升高，但当温度超过50℃时，综合评分减小，40℃和60℃的综合评分均小于50℃。综合考虑，实验中选择50℃为包合的最佳温度。

3.1.2包合时间对包合的影响 先精密称取龙血竭粉末，加入适量95%乙醇使其充分溶解，再精密称取HP-β-CD粉末至100 mL烧杯中，加入40 mL蒸馏水使其充分溶解，主客分子质量比为1∶8，边搅拌边滴加龙血竭乙醇溶液，50℃下恒温搅拌时间分别为1、2、3、4 h，抽滤，滤液水浴蒸干，即得龙血竭HP-β-CD包合物。结果见表4。

表4 包合时间对包合的影响

由表4可知，随着包合时间的增大，包合率和综合评分变化并不显著，收率有所降低，考虑到2 h和4 h的综合评分均低于3 h的综合评分，所以实验选择3 h为最佳包合时间。

3.1.3包合速度对包合的影响 先精密称取龙血竭粉末，加入95%乙醇使其充分溶解，再精密称取HP-β-CD粉末至100 mL烧杯中，加入40 mL蒸馏水使其充分溶解，主客分子质量比为1∶8，50℃下分别用不同速度搅拌3 h，边搅拌边滴加龙血竭乙醇溶液，滴加完毕开始计时，抽滤，滤液水浴蒸干即得龙血竭HP-β-CD包合物。结果见表5。

表5 包合速度对包合的影响

由表5可知，随着搅拌速度的改变，对包合率和收率均没有太大影响，不过从表中可以看出，包合速度为400 r/min时，其包合率、收率和综合评分均高于其余两者，所以实验中选择的包合速度为400 r/min。

3.1.4主客分子质量比对包合的影响先精密称取龙血竭粉末，加入95%乙醇使其充分溶解，再精密称取HP-β-CD粉末至100 mL烧杯中，加入40 mL蒸馏水，使其充分溶解，50℃下用中速搅拌3 h，主客分子质量比分别为1：6、1∶8、1∶10、1∶12，边搅拌边滴加龙血竭乙醇溶液，抽滤，滤液蒸干，即得龙血竭HP-β-CD包合物。结果见表6。

表6 主客分子质量比对包合的影响

由表6可知，主客分子质量比为1∶12的综合评分明显低于前三组，前三组实验的包合率、收率、综合评分均无太大差异，质量比为1∶8的收率和综合评分均高于质量比为1∶6和1∶8，综合考虑，选择主客分子最佳质量比为1∶8。

3.2 包合物制备工艺条件正交优选

3.2.1正交试验设计 影响包合率的因素有很多，比如包合时间、包合温度、包合速度、主客分子质量比等因素。通过单因素考察试验选择包合时间、包合温度、主客分子质量比作为正交试验因素，每个因素选择三个水平：包合时间2、3、4 h（A）；包合温度40、50、60 ℃（B）及主客分子质量比1∶6、1∶8、1∶10（C），以包合率和包合物收率的综合评分为评价指标，权重系数分别为0.8、0.2，进行3因素3水平L9（34）正交试验设计，选择最佳制备工艺。因素水平表见表7、正交试验结果见表8、方差分析结果见表9。

表7 因素水平表

表8 正交试验结果

表9 方差分析结果

通过统计分析，影响包合率的主次因素为C＞A＞B，但是A、B两因素中的三个水平很接近，遵照操作方便原则，因素选择A1、B1，C因素中二、三水平比较接近，所以选择C2。最后确定包合物的制备工艺条件为A1B1C2，即包合时间2 h，包合温度40℃，龙血竭与HP-β-CD质量之比为1∶8。

3.2.2包合工艺验证 根据正交试验优选的最佳制备工艺条件，平行制备三批包合物，并测定其包合率和包合物收率的综合评分。结果见表10。

由表10可知，综合评分均高于正交试验中各试验结果，三批包合物的包合率、收率和综合评分的相对平均偏差较小，说明该制备工艺重现性好，合理可行。

表10 包合工艺验证结果

4 包合物评价

4.1 紫外光谱扫描（UV）将适量包合物、羟丙基-β-环糊精、龙血竭与羟丙基-β-环糊精物理混合物以及龙血竭分别溶于水中，在室温下于200～800 nm范围进行紫外扫描，结果如图3。

图3 紫外扫描图谱：1为包合物；2为HP-β-CD；3为物理混合物；4为龙血竭

由紫外扫描图谱可知，包合物在285 nm左右有1个吸收峰，HP-β-CD、物理混合物、龙血竭在285 nm处没有吸收峰，故表明龙血竭与HP-β-CD形成了新的物相。

4.2 差示扫描量热法（DSC）精密称取龙血竭粉末、羟丙基-β-环糊精、龙血竭羟丙基-β-环糊精的简单混合物、包合物四个样品各5 mg进行差示扫描热分析：氧化铝为参比物，量程±100 μV，升温范围30～350℃，升温速率为10℃/min，得DSC图谱，结果见图4。

图4 DSC图谱：1为HP-β-CD；2为包合物；3为物理混合物；4为龙血竭

由DSC图谱可知，龙血竭与物理混合物二者都出现吸热峰，即游离龙血竭可产生吸热峰。而HP-β-CD未出现吸热峰，可排除载体材料的干扰。包合物没有出现吸热峰，即可证明龙血竭与HP-β-CD形成了包合物。

4.3 溶解性取10 mL水，分别精密称取龙血竭粉末和龙血竭-羟丙基-β-环糊精包合物粉末，使之成为饱和溶液，结果龙血竭几乎不溶，龙血竭包合物的溶解度为656.74 mg/mL，明显高于龙血竭，表明羟丙基-β-环糊精的包合对龙血竭的水溶性有显著提高。

5 讨论

在龙血竭-羟丙基-β-环糊精包合物的制备过程中，分别比较了研磨法、超声法、中和法、饱和水溶液法和水溶液搅拌法［10-12］，分别称取上述五种方法制备的包合物，加入适量水中使其溶解，结果显示水溶液搅拌法制备的包合物可完全溶解，而其余四种方法制备的包合物不能充分溶解，所以本实验选择水溶液搅拌法制备龙血竭羟丙基-β-环糊精。

由于龙血竭微溶于水，溶出和吸收慢，导致体内生物利用度低，而β-环糊精的“内亲脂，外亲水”的立体双亲性孔腔结构可以用于龙血竭的包合，从而明显提高龙血竭的溶解度，为该制剂的研究开发提供了一条新的制剂开发路径。