化香树果序多糖脱蛋白工艺研究

张丽华，刘裕，赵鹏，张婷婷，杜永鹏

作者单位：1陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；2咸阳市丽彩医药有限公司，陕西 咸阳 712046

化香树为胡桃科植物，药用部位为其干燥果序，具有清热燥湿，消肿散於，止痒杀虫等功效［1-4］。通过相关文献报道和临床实验表明，化香树果序中的多糖成分具有较好的抗氧化活性［5］。

多糖是由10个以上的单糖经过糖苷键连接而成的糖链。它是中药中普遍存在的一种成分，具备免疫调节、抗肿瘤抗癌、降血糖血脂、抗衰老、抗辐射等药理作用，其中免疫促进作用是最重要的［6］。基于多糖在临床疾病方面的广泛应用和作为美容食品、化妆品、保健品的有效成分，因而多糖具备较大的开发利用价值。

但在对提取的多糖进行药理活性研究时，发现多糖中蛋白质对药理活性的研究影响较大，因此对得到的粗多糖进行除蛋白处理就非常必要而且关键［7-8］。酶法是以酶为催化剂使多糖溶液中的蛋白质发生反应从而达到去除蛋白的作用，所以此方法脱蛋白效果较好。同时，由于酶专一性较高，该酶不会与多糖发生结合，多糖保留率较高，所以，该法为效果较好的多糖蛋白脱除方法［9-11］。因此，本实验自2018年1—4月通过对木瓜蛋白酶脱除过程中的酶作用条件进行了重点研究，最终筛选确定了化香树果序多糖脱蛋白的最佳工艺路线，并通过响应面法优化筛选出了其最优的蛋白脱除条件，为化香树果序多糖的进一步应用研究做了贡献。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器材料：化香树果序粗多糖（通过本实验室制得，含量46.65%），三氯甲烷（AR）、正丁醇（AR）、小牛血清白蛋白（AR）、考马斯亮蓝（AR）、浓硫酸（AR）、木瓜蛋白酶（活力单位＞4万U/g，北京鼎国生物技术有限责任公司）。

仪器：HHS恒温水浴锅（巩义予华仪器厂）；AL204型分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；UV-265型紫外分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 实验方法

1.2.1蛋白质标准曲线的绘制 本实验采用考马斯亮蓝染色法，此方法的原理是考马斯亮蓝G-250染料在游离状态为红色，当它与蛋白质结合后则呈现蓝色，在一定浓度范围内蛋白质的浓度和溶液在595 nm波长下的吸光度呈正比［10］。将100 mg考马斯亮蓝G-250溶解于50 mL 95%乙醇中并搅拌均匀，在向其中加入100 mL 85%（W/V）磷酸溶液，加蒸馏水至1 000 mL刻度线处进行定容。取10 mg牛血清白蛋白加一定的蒸馏水，用容量瓶配制成0.1 mg/mL的标准蛋白质溶液。取6支具塞试管，分别移入标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL配制成不同浓度的6管溶液，定容至2 mL，再加入5 mL考马斯亮蓝G-250显色剂，充分振荡混合均匀后静置显色2 min，用比色法将空白溶液作为对照组，在波长595 nm处测定各管溶液的吸光度，测定应在1 h内完成。以牛血清白蛋白含量为x轴，以吸光度为y轴，拟合得标准曲线方程：y＝6.598 6x+0.013 2，R2＝0.998 2，呈良好的线性关系。

1.2.2蛋白质浓度［10］的测定 准确配制5 mg/mL的多糖溶液，取两只具塞试管，第一管中加入1.0 mL多糖溶液，在第二管管中加入1.0 mL蒸馏水，并分别取考马斯亮蓝5.0 mL加入两管中，振荡摇匀，静置显色2 min，在595 nm处以第二管溶液为对照组调零，测第一管溶液吸光度，根据上述所得标准曲线求得该多糖中蛋白的浓度C前。蛋白脱除率的计算：

式中：C前：为多糖脱蛋白前蛋白质的浓度；C后：为多糖脱蛋白后蛋白质的浓度。

1.2.3化香树果序多糖保留率计算 应用苯酚-硫酸

法［10］测定多糖含量，化香树果序多糖的保留率计算：

式中：M前：为多糖脱蛋白前多糖的含量；M后：为多糖脱蛋白后多糖的含量。

1.3 统计学方法响应面分析方法［12］是目前经常采用的一种试验设计方法。通过合理的试验设计进行试验，并对试验得到的数据，应用Design-Expert v7.1.3软件，进行多元二次回归方程数据拟合，绘制响应曲面和等高线图，分析预测得到较优工艺参数。Design-Expert v7.1.3软件是专业响应面分析软件，能够大大地减少所需要的实验次数，提高实验效率。响应面法相对于正交试验法，精密度高、预测值接近真实值，结果更加合理、可靠。

2 结果

2.1 木瓜蛋白酶法脱蛋白

2.1.1酶用量 分别将0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%（酶底比）的木瓜蛋白酶加入到预先准备好的5支含1 mL化香树果序粗多糖溶液的试管中，放在水浴锅中，设置温度为50℃，在pH值为7.0条件下，保温1 h，3 000 r/min离心5 min，倾倒出上层脱蛋白的多糖溶液。实验结果如图1所示。

图1 酶用量对蛋白脱除率的影响情况

根据图1可知，当酶用量增大时，蛋白脱除率随之而迅速增大；当酶用量达到1.5%时，蛋白脱除率达到最大值80%，之后慢慢趋于稳定，则说明酶用量为1.5%时蛋白脱除率较佳。

2.1.2酶解时间 将1.5%（酶底比）的木瓜蛋白酶加入到预先准备好的5支含1 mL化香树果序粗多糖溶液的试管中，放在50℃水浴锅中，在pH值为7.0条件下，保温并依次放置 30、60、90、120、150min，然后以3 000 r/min离心5 min，倾倒出上层脱蛋白的多糖溶液。实验结果如图2所示。

图2 酶解时间对蛋白脱除率的影响情况

由图2可知，蛋白脱除率随酶解时间的不断增大，蛋白脱除率逐渐上升，在90 min时蛋白脱除率到达最大，之后又随酶解时间的增加而逐渐减小，因此，酶解时间90 min为较佳时间。

2.1.3酶解温度 将1.5%（酶底比）的木瓜蛋白酶加入到预先准备好的5支含1 mL化香树果序粗多糖溶液的试管中，分别放在40、50、60、70、80 ℃水浴锅中，在pH值为7.0条件下，保温放置90 min，然后以3 000 r/min离心5 min，倾倒出上层脱蛋白的多糖溶液。实验结果如图3所示。

图3 酶解温度对蛋白脱除率的影响

从图3可以看出，温度在40℃到60℃之间时，蛋白脱除率随温度的升高逐渐增大；当达到60℃时，蛋白脱除率达到最大；温度在60℃到80℃之间又随温度的升高而降低。因而，酶解温度60℃为较佳温度。

2.1.4pH值 将1.5%（酶底比）的木瓜蛋白酶加入到预先准备好的5支含1 mL化香树果序粗多糖溶液的试管中，放在60℃水浴锅中，分别在pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0条件下，保温放置90 min，然后以3 000 r/min离心5 min，倾倒出上层脱蛋白的多糖溶液。实验结果如图4所示。

图4 pH值对蛋白脱除率的影响

由图4中可知，当在中性环境时，蛋白脱除效果较好，在酸性和碱性环境时，蛋白脱除效果较差，因此需在中性环境条件下对多糖溶液进行酶解处理。

2.2 响应面由上述实验可知，木瓜蛋白酶适宜环境是中性，因此在进行响应面优化试验时固定pH值为7.0，以蛋白脱除率为指标，使用酶用量、酶解时间、温度3种因素进行15次试验。响应面因素与水平设计见表1，响应面分析方案见表2。

根据Design-Expert v7.1.3软件拟合得到回归方程为：

2.2.1响应值结果及其拟合模型 根据表3的分析结果可知，通过Design-Expert v7.1.3软件拟合得到的模型显著水平远远小于0.05（P＜0.000 1），说明该模型是有统计学意义的，从失拟性检验结果来看，失拟误差并不显著（P＝0.094 8），这说明实验中的未知因素对于试验结果影响不大，预测的回归模型与实际实验结果拟合效果较好。由于预测模型的R2＝0.997 2，说明蛋白脱除率的实验值与预测值之间的存在着良好的一致性，该模型的变异系数CV＝0.51%＜5%，校正系数R2Adj＝0.992 3，这说明预测的模型可以反映响应值为99.23%的变化，因此通过回归方程能够预测试验的最佳工艺。通过表3方差分析结果可知，各单因素中，影响化香树果序多糖蛋白脱除率最大的是反应温度，其次是时间，其中最不显著的是酶的加入量，酶用量与时间之间的交互影响最为显著。

表1 响应面分析因素与水平

表2 Box-Behnken设计方案及响应值

表3 方差分析表

图5 酶用量和温度对蛋白脱除率的交互影响

图6 时间和酶用量对蛋白脱除率的交互影响

图7 时间和温度对蛋白脱除率的交互影响

2.2.2响应面图分析 根据图5～7分析可知：酶解温度对蛋白脱除效果的影响较大，曲线变化趋势较陡；而酶解时间和酶用量对蛋白脱除效果的影响较小，曲线变化趋势平缓。对回归模型方程求一阶偏导：X1＝0.016，X2＝0.951，X3＝0.23［13-14］，然后将三个数值带入回归方程，则可计算得到：在酶用量1.508%，酶解温度64.76℃，酶解时间92.3 min时，蛋白脱除率为90.82%。

2.2.3优化条件重复验证试验 为了便于实验，将脱蛋白的条件设定为：酶用量1.508%，温度65℃，酶解时间92.3 min，pH＝7.0进行3次重复验证试验，试验结果如表4所示。

表4 验证试验结果/%

从表4可以看出，蛋白脱除率和多糖保留率在酶用量1.508%，酶解温度64.76℃，酶解时间92.3 min条件下均较高，化香树果序多糖脱蛋白试验重现性较高。

3 结论

研究发现，多糖中的蛋白往往会影响到多糖的活性，其是以结合或者游离态存在，对多糖的脱蛋白纯化工作，均是为了去游离蛋白质而不破坏结合蛋白质，所以确定脱蛋白工艺路线时，一方面要尽可能得除去游离蛋白质，另一方面也要尽可能地减少多糖-蛋白质类复合物、多糖大分子的降解。目前应用较多的脱蛋白工艺是反复应用Sevage法，该工艺最大的缺点就是多糖保留率低、费时和溶剂量大；也有人采用三氯乙酸和盐酸法等工艺，其蛋白脱除率很高，但多糖在酸性环境下容易发生降解，因此其应用受到了一定的限制。相对而言酶法脱蛋白工艺具有条件温和，蛋白脱除率较高等优点引起了研究者的兴趣。本研究经过对比上述几种多糖蛋白的脱除工艺之后，最终选择应用木瓜蛋白酶工艺，并通过响应面法确定了其最佳脱蛋白条件为：在酶用量1.508%，温度65℃，酶解时间92.3 min，pH＝7.0的条件下，化香树果序多糖蛋白脱除率是90.90%，多糖保留率是84.06%。对进一步加深对化香树果序多糖的研究具有一定的意义。