富含铁元素食物对非洛地平片在Beagle犬体内药动学的影响

陈仕云，何勇，于艳英，彭扶云，高永好，吴宗好

作者单位：1合肥学院分析测试中心，安徽 合肥 230601；2合肥华方医药科技有限公司，安徽 合肥 230088

非洛地平为第Ⅱ代二氢吡啶类钙通道阻滞药，通过抑制小动脉平滑肌细胞外钙内流并增加冠状窦血流量，降低全身冠状动脉血管阻力，低血压降，具有长效、不良反应少等优点，临床用于轻度以及中度高血压治疗［1］。非洛地平经胃肠道吸收快而完全，空腹服用易被肝脏代谢为非活性代谢物，从而使生物利用度降低；进食后，食物中的有效活性成分抑制或改变药物非洛地平的体内代谢过程，服用葡萄柚汁［2］可引起非洛地平以及代谢产物的AUC和Cmax增加几倍，是因为葡萄柚汁能减少其首过效应，通过抑制非洛地平在肠室的代谢而起作用［1］。文献报道了非洛地平餐后给药药动学参数试验［3］，本试验自2017年1月至2018年3月探讨高铁饮食对非洛地平片在Beagle犬体内的药动学的影响，通过液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）方法［4-10］测定受试者血浆中的非洛地平浓度，分别计算空腹、餐后药动学参数，分析其差异来评价食物效应［11］对非洛地平在Beagle犬体内的药动学影响。

1 材料与方法

1.1 材料非洛地平片，每片规格：5 mg（江苏联环药业股份有限公司；批号：20160703）；非洛地平对照品（纯度99.9%，批号：100717-201403）购自中国食品药品检定研究院，尼群地平对照品（纯度≥95%，批号：C10039115）购自上海麦克林生化科技有限公司。甲醇（色谱纯，Tedia）；其它试剂均为AR级。

1.2 仪器Agilent1290-2超高压液相色谱仪，AB4000三重四级杆串联质谱仪（ESI+源），Analyst1.6.3数据采集系统；GL-16G型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；SZ-1型快速混匀器（常州国宇仪器制造有限公司）；BF-2000氮气吹干仪（冠森生物科技（上海）有限公司）；AG135型电子分析天平等。

1.3 试验对象健康Beagle犬，雌雄各半［安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（皖）2011-002］。试验前Beagle犬在SPF动物实验室饲养1周。于试验前12h禁食，试验过程中自由饮用去离子水。本研究对犬的处置符合动物学伦理标准。

1.4 方法

1.4.1液相色谱-质谱条件 色谱条件：色谱柱岛津C18（1.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水相（4 mmol/L醋酸铵，含0.15%甲酸）＝85∶15；流速∶0.5mL/min；进样量：10 μL；柱温：室温。

质谱条件：离子源：电喷雾电离源（ESI源），正离子检测模式；检测模式多反应监测（MRM）；气帘气流速：25.0 L/min；碰撞气流速中等；喷雾电压：5 500.0 V；离子源温度：500.0℃；雾化气：Gas1 50.0 L/min；辅助气：Gas2 50.0 L/min；扫描时间：100.0 ms；监测离子对m/z384.1→m/z338.1（非洛地平），m/z361.2→m/z 315.2（尼群地平）；去簇电压分别为77 V和85 V；碰撞能量分别为14 V和17 V。

1.4.2试验设计 采用随机、开放、单剂量给药、双交叉试验设计，将健康Beagle犬12条，体质量（20±2）kg，采用随机数字表法分为A、B两组，每组6条。A组依次空腹给药、高铁食物餐后给药；B组依次高铁食物餐后给药、空腹给药，洗脱期为7 d，给药量均为每片5 mg。

试验前1 d所有受试者Beagle犬进入饲养动物房，正常饲养，确保试验前禁食不禁水10 h以上。于次日早晨A组用200 m L温水送服非洛地平片1片；B组于给药前30 min统一进食高铁试验餐（5 g紫菜-200 mL去离子水），并于30 min内进餐完毕后立即服药。除给药前1 h至给药后1 h外任意饮水，4 h后统一饲养。于给药前0和给药后0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、24、48 h前腿静脉处采集血样约3 mL。血样置于含EDTA抗凝管中，立即在3 000 r/min条件下离心10 min，分取上层血浆，于-20℃保存，备用。

1.4.3血浆样品预处理 精密量取血浆200 μL，内标物10 μL，混合混匀；加甲醇600 μL，涡旋3 min；3 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm膜滤，10 μL进样分析（避光操作）。

1.4.4溶液配制 非洛地平标准溶液：取非洛地平对照品约15 mg，精密称定，置50 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作标准储备液Ⅰ（300 μg/mL）。精密吸取标准储备液Ⅰ1.0 mL，置10 mL棕色量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，作为标准储备液Ⅱ（30 μg/mL）。精密量取标准储备液Ⅱ适量，用甲醇稀释即得。

内标物溶液：取尼群地平对照品约10 mg，精密称定，置100 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解、稀释定容刻度，摇匀，作为内标储备液（100 μg/mL）。精密量取内标储备液0.1 mL，置100 mL棕色量瓶中，甲醇稀释、定容至刻度，摇匀，得内标溶液（100 ng/mL）。

1.4.5方法专属性 依次取6条受试犬空白血浆200 μL，按“血样处理”项下方法（未加内标物溶液），参照2.1项下色谱-质谱条件下进样分析，得色谱图1A；将内标物溶液和一定浓度非洛地平标准溶液加至空白血浆中，依次操作，得色谱图1B；取口服给药后受试犬血浆样品并加内标物，依次操作，得色谱图1C。空白血浆中代谢物质、内源性物质不干扰血浆内标物和非洛地平测定，非洛地平、内标物保留时间为6.8 min和5.5 min。

1.4.6线性试验 取空白血浆200 μL，分别加非洛地平标准储备液溶液10 μL，配置相当于非洛地平血浆浓度1.0、2.0、50、10.0、20.0、30.0 ng/mL的模拟血浆样品，按“2.3”项下操作，进样10 μL，记录色谱图。以非洛地平浓度（C，ng/mL）为横坐标，非洛地平与内标物的峰面积比（R）为纵坐标，计算直线回归方程，得标准曲线：R＝0.064 43X+0.255 77，r＝0.999 4。结果表明，非洛地平血浆浓度在1.0～30.0ng/mL范围之间与峰面积线呈线性关系，相关性较好，定量限1.0 ng/mL。

1.4.7方法精密度与准确度 取空白血浆200 μL于试管中，加非洛地平储备溶液适量，配成高、中、低3个浓度（非洛地平浓度分别为25.0、10.0、1.0 ng/mL）模拟血浆的样品，各5份，进行样品测定。代入方程，计算浓度，测得值/加入值计算回收率，连续3 d配样测定、计算日内差、日间差。结果显示：准确度在85%～115%范围内，日内、日间差RSD均小于15%。

1.4.8回收率和基质效应试验 分别配制高、中、低浓度（25.0、10.0、1.0 ng/mL）非洛地平对照品溶液（含内标物）A；取空白血浆，按“2.3”项下方法操作，吹干后并加入非洛地平和内标对照溶液，分别制备高、中、低浓度血样B；取空白血浆，分别加入适量药和内标对照品溶液，按“血样处理”项下方法操作，分别制备低、中、高浓度血样C。依次进样，记录色谱图。计算非洛地平基质效应为93.4%～108.9%，内标的基质效应为96.7%～105.3%；非洛地平的萃取回收率为75.76%～81.44%，内标的平均萃取回收率为83.6%。

1.4.9稳定性试验 分别配制低、中、高3个浓度的血浆样品，于室温条件下放置8 h、经反复冻融3次、-20℃保存15 d后测定。结果显示，非洛地平血浆样品，在室温放置8 h、反复冻融3次上、-20℃保存保存15 d条件下稳定，不影响试验结果。

2 结果

采用DAS3.2.8软件处理血药浓度数据，用非房室模型参数计算，根据各受试犬血药浓度实测数据计算主要药动学参数。得主要药动学参数见表1。两组Beagle犬给药后药代动力学参数经方差分析和t检验，Cmax、AUC0-12和AUC0-∞，均差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组的Cmax、AUC0-12和AUC0-∞明显比正常组低，说明实验组的吸收程度不如正常组，食物中的Fe3+可能抑制非洛地平吸收。

表1 12条Beagle犬空腹和高铁饮食后口服非洛地平片5 mg的主要药动学参数/（n＝6，±s）

表1 12条Beagle犬空腹和高铁饮食后口服非洛地平片5 mg的主要药动学参数/（n＝6，±s）

参数Tmax/h Cmax/（ng/mL）T1/2/h AUC0-12/（ng·h-1·mL-1）AUC0-∞/（ng·h-1·mL-1）空腹1.25±0.24 12.59±2.17 1.1±0.69 19.46±5.23 20.69±5.75高铁饮食后1.32±0.35 7.13±2.96 1.2±0.72 11.87±3.85 12.76±4.18 F值0.294 17.014 0.128 10.381 10.613 P值0.599 0.002 0.728 0.009 0.009

3 讨论

本研究每片非洛地平5 mg，属于小剂量制剂，给药后血药浓度比较低，选择液-质联用方法进行血样定量分析；此研究的方法专属性强、灵敏度高、快速准确。非洛地平和内标均见光易分解，整个样品处理过程中应在避光条件下快速进行；因此，采用沉淀法处理血浆样品，操作简单，提取回收率高，而血浆中的内源性成分或代谢产物不干扰检测。

分析药时曲线图和药动学参数可知，与空腹相比较，高铁食物组Beagle犬对非洛地平的吸收相对较差，达峰浓度降低，其相对生物利用度（F）（61.0±12.7）%；查阅相关文献［12-13］，Fe3+在酸性条件中可将二氢吡啶类化合物氧化，推测富含Fe3+食物在酸性条件下可将非洛地平氧化成杂质［14］，说明食物中的Fe3+抑制了非洛地平吸收。降解杂质产生机制见图2。

图1 血浆中非洛地平和内标尼群地平的典型色谱图：A为空白血浆；B为空白血浆加入非洛地平（15 ng/mL）和内标尼群地平（10 ng/mL）；C为受试犬服药后2 h血浆加入内标尼群地平（10 ng/mL）

图2 降解杂质路线图

由此推测，食用含有Fe3+食物后［15-16］，服用二氢吡啶类药物，降解杂质或有关物质增加，可影响生物利用，也可能是二氢吡啶类药物不良反应［14］较多原因之一。因此口服非洛地平片建议餐前服用或餐后补充维生素C消耗体内Fe3+［17］。