大鼠血清25羟维生素D水平与年龄相关性白内障的关系

刘兵

作者单位：自贡市第四人民医院眼科，四川 自贡 643000

年龄相关性白内障（age-related cataract，ARC）又称老年性白内障，是一种与年龄密切相关的白内障疾病［1-2］。作为我国最常见的致盲性眼病，随着全国人口平均寿命的延长，年龄相关性白内障的患病率也在逐年增加［3-4］。关于老年性白内障的预防及治疗引起了越来越多学者的关注。25羟维生素D（25-OH-VD）是维生素D在体内的主要存在形式，作为人体中不可或缺的营养素之一，它不仅影响钙磷的代谢，而且有广泛的生理作用，是维持人体健康、细胞生长和发育的必不可少的物质［5-6］。血清中25羟维生素D的高低可以反映人体维生素D的储存水平，与多种疾病密切相关［7-8］。关于血清25羟维生素D水平与年龄相关性白内障关系的报道较少，其作用机制目前也不清楚。因此，本研究自2017年2月至2018年2月通过注射补充维生素D的方式调节血清内25羟维生素D水平，观察其对年龄相关性白内障的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物健康1月龄SPF级Wistar大鼠，体质量范围为50～60 g，雌雄各半，购于北京维通利华有限责任公司，室温、12 h∶12 h明暗交替喂养。动物合格证号：SCXK（京）2015-0001。本研究对大鼠的处置符合动物伦理学原则。

1.2 方法

1.2.1年龄相关性白内障大鼠模型构建 Wistar大鼠采用1%阿托品滴眼液进行散瞳处理后，采用随机数字表法分为空白对照组、年龄相关性白内障模型组、维生素D低剂量组（维生素D1 250 IU/d）、维生素D高剂量组（维生素D2 500 IU/d），每组10只。

实验开始前，对照组与模型组大鼠舌下静脉注射10%葡萄糖溶液（5 mL/kg），维生素D对照组注射维生素D葡萄糖溶液。15 min后，除空白对照组外，其余三组均腹腔注射50%浓度的D-半乳糖生理盐水注射液（剂量为25 g-1·kg-1·d-1），对照组注射等量的生理盐水。连续注射3周并定期对大鼠进行散瞳处理，观察晶状体浑浊情况。

注：本研究的造模方法“大鼠舌下静脉注射10%葡萄糖溶液（5 mL/kg），维生素D对照组注射维生素D葡萄糖溶液。15 min后，除空白对照组外，其余三组均腹腔注射50%浓度的D-半乳糖生理盐水注射液（剂量为25 g-1·kg-1·d-1）”，其诱发白内障的原理是晶状体前皮质和核的混浊，其与临床的青光眼性白内障发病途径比较接近。青光眼性白内障即为青光眼引起的白内障多由晶状体前皮质和核开始，逐渐使晶状体全混浊。以后水分吸收，囊膜增厚，晶状体囊膜皱缩，并有钙化等变化。其关键病因即为晶状体的变化，故检测眼压以明确其症状的进展情况。

1.2.2眼压及血清中25羟维生素D的检测 采用眼压计检测大鼠眼压，结果取3次平均值；采集外周血（眼底取血），EIA法测定血清中25羟维生素D的含量。

1.2.3晶状体上皮细胞的分离培养 大鼠颈处死后取晶状体上皮组织，生理盐水冲洗后剪碎并加入胰蛋白酶（1.5 g/L）消化培养25 min（37℃、5%二氧化碳）；然后加入含有5%FBS的DMEM培养基，离心并用PBS洗涤，该过程重复3次。随后调整细胞水平并接种于培养板上，细胞培养箱中传代培养，2～3 d更换1次培养液。细胞传代3次后收集细胞，以便后续检测。

1.2.4聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测DPPⅡ、cmycmRNA基因表达的变化 采用RT-PCR方法检测DPPⅡ、c-mycmRNA基因表达水平。PCR扩增条件为：97℃预变性2.5 min，94℃变性30 s，60℃退火25 s，70℃延伸30 s，循环30次，最后72℃延伸60 s。取10 μL扩增产物和6 μL的DGL-200 Maker同时上样，于2.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，紫外凝胶成像系统分析扩增结果并拍照。DPPⅡ、c-myc以及βactin引物设计，见表1。

1.2.5免疫印迹（Western Blot）分析相关蛋白表达水平变化 配置一定浓度的SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶并置于电泳槽上，分别取各组条件下的蛋白15μL上样并电泳。电泳后转印到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭并用TBST清洗后分别加入稀释过的蛋白抗体（1抗），4℃过夜，TBST清洗4次（每次5 min）；随后加入HRP标记的2抗，37℃孵育2 h，TBST洗4次×5 min。设立阴性对照组，以GAPDH单克隆体为一抗，HRP标记的IgG为二抗。

1.3统计学方法本研究中数据全部采用SPSS 20.0统计分析软件（美国IBM公司）进行处理；计量资料采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用χ2分析；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组基本情况白内障模型组、维生素D给药组与空白对照组大鼠的基本情况见表1。由表1可知，对照组、模型组及各给药组之间大鼠体质量、收缩压及舒张压均差异无统计学意义（P＞0.05）且均在正常范围内，见表2。

表1 PCR过程中引物序列设计

表2 白内障模型组、给药组与对照组大鼠基本情况/±s

表2 白内障模型组、给药组与对照组大鼠基本情况/±s

组别空白对照组白内障模型组维生素D低剂量组维生素D高剂量组F值P值鼠数10 10 10 10体质量/g 54.62±7.65 54.49±8.54 55.85±8.72 56.42±4.55 1.346 0.412收缩压/mmHg 121.32±6.05 120.49±6.54 120.85±5.72 120.35±6.25 1.287 0.399舒张压/mmHg 77.62±5.25 78.43±4.94 78.62±5.37 78.30±5.20 1.453 0.428

2.2 25羟维生素D水平与年龄相关性白内障大鼠眼压的关系与空白对照组相比，白内障模型组25羟维生素D水平降低，眼压升高；维生素D给药后，维生素D水平较模型组升高，眼压降低，差异有统计学意义（25羟维生素D水平：F＝9.215，P＝0.007；眼压：F＝12.502，P＝0.005），且以高剂量给药组效果最明显，且随着维生素D水平的升高，大鼠眼压逐渐降低，见表3。

2.3 25羟维生素D水平与白内障大鼠晶状体浑浊情况的关系裂隙灯显微镜观察可知，空白对照组大鼠始终保持晶状体透明；注射3周后，白内障模型组中2只晶状体高度浑浊（3级），8只晶状体呈肉眼可见的浑浊（4级）。姜黄素低剂量给药后，4只大鼠晶状体呈3级浑浊，6只大鼠晶状体呈4级浑浊；高剂量给药后，分别有2只、4只、6只大鼠呈现2级、3级和4级浑浊。综合分析25羟维生素D水平与白内障大鼠晶状体浑浊情况可知，血清中维生素D水平越低，晶状体浑浊程度越严重；给药后，血清中维生素D水平有一定程度的恢复，晶状体浑浊程度降低，差异有统计学意义（F＝11.635，P＝0.003），见表4。

表3 25羟维生素D水平与年龄相关性白内障大鼠眼压的关系/xˉ± s

2.4 25羟维生素D水平对晶状体上皮细胞LEC凋亡的影响各组LEC细胞凋亡率均随时间延长而缓慢增加；白内障模型组晶体上皮细胞凋亡率高于空白对照组，差异有统计学意义（F＝8.212，P＝0.016）；与模型组相比，给药组各时间段的LEC细胞凋亡率下降，且以高剂量组降低效果最明显。综合分析25羟维生素D水平与LEC细胞凋亡率可知，血清中维生素D水平越低，LEC细胞凋亡率越高；给药后，血清中维生素D水平有一定程度的回升，LED凋亡程度降低，差异有统计学意义（1周：F＝10.258，P＝0.0111；2周：F＝13.390，P＝0.005；4周：F＝14.157，P＝0.003），见表5。

2.5 血清中25羟维生素D水平对年龄相关性白内障大鼠晶状体上皮细胞DPPⅡ、c-myc基因表达水平的影响与对照组相比，白内障模型组大鼠晶状体上皮细胞DPPⅡ、c-myc基因表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。给药后，随着血清中25羟维生素D水平的回升，DPPⅡ、c-myc表达的降低，且血清中维生素D水平较高时降低效果更为明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，血清中25羟维生素D可有效抑制DPPⅡ、c-myc基因的表达，从而达到减缓并抑制白内障的发病，见表6，图1。

表5 25羟维生素D水平对晶状体上皮细胞LEC凋亡的影响/±s

表5 25羟维生素D水平对晶状体上皮细胞LEC凋亡的影响/±s

组别空白对照组白内障模型组维生素D低剂量组维生素D高剂量组F值P值鼠数10 10 10 10 25羟维生素D水平/（ng/mL）21.53±4.25 19.20±2.63 26.46±3.51 35.32±4.52 8.212 0.016 LEC细胞凋亡率/%1周3.42±1.93 12.60±2.26 8.86±2.34 6.07±3.13 10.258 0.011 2周4.35±1.06 18.23±3.06 10.24±2.87 8.23±2.06 13.390 0.005 4周6.52±1.76 25.72±4.24 13.52±3.40 10.72±2.24 14.157 0.003

表6 血清中25羟维生素D水平对DPPⅡ、c-myc基因表达水平的影响/（ng/mL，±s）

表6 血清中25羟维生素D水平对DPPⅡ、c-myc基因表达水平的影响/（ng/mL，±s）

组别空白对照组白内障模型组维生素D低剂量组维生素D高剂量组F值P值鼠数10 10 10 10 DPPⅡ（灰度值）1.31±0.06 4.18±0.21 2.31±0.72 2.03±0.40 11.217 0.008 c-myc（灰度值）1.02±0.05 3.89±0.31 2.25±0.62 1.91±0.41 13.087 0.005

图1 RT-PCR检测DPPⅡ、c-myc基因表达情况

2.6 血清中25羟维生素D水平对年龄相关性白内障大鼠晶状体上皮细胞TNF-α、IL-8蛋白表达水平的影响与对照组相比，模型组大鼠晶状体上皮细胞TNF-α、IL-8蛋表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。给药组与模型组相比，随着血清中25羟维生素D水平回升，均有下调TNF-α、IL-8表达的效果，差异有统计学意义（P＜0.05），且血清中维生素D水平较高时降低效果更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，血清中25羟维生素D可有效抑制TNF-α、IL-8基因的表达，从而达到减缓并抑制白内障的发病，见表7，图2。

表7 NE及BOD对感染性休克大鼠TNF-α、IL-8蛋白表达水平的影响/±s

表7 NE及BOD对感染性休克大鼠TNF-α、IL-8蛋白表达水平的影响/±s

指标空白对照组白内障模型组维生素D低剂量组维生素D高剂量组F值P值鼠数10 10 10 10 TNF-α（灰度值）1.25±0.04 5.28±0.21 3.48±0.61 2.63±0.31 12.023 0.002 IL-8（灰度值）1.12±0.08 4.63±0.50 2.59±0.71 2.14±0.30 10.419 0.005

图2 Western Blot检测TNF-α、IL-8蛋白表达情况

3 讨论

年龄相关性白内障是一种与年龄相关的致盲率较高的晶状体浑浊性疾病［9-10］。随着年龄的增长，晶状体中变性蛋白质和脂质不断累积，在多种因素的综合作用下导致白内障疾病的产生［11-12］，其公认的治疗手段为手术治疗，但早期白内障术后疗效不佳，部分病人不适于手术，因此预防就显得尤为重要。

DPPⅡ（二肽基肽酶Ⅱ）作为一种细胞内溶酶体蛋白酶，广泛存在于晶状体中，与年龄相关性白内障的发病密切相关［13］。c-myc基因是原癌基因家族的重要成员，与晶状体上皮细胞的增殖、分化和凋亡密切相关，它的过度表达可促进白内障的发生［14-15］。TNF-α由LPS刺激过量产生，可通过刺激内皮细胞及诱导炎症因子的产生导致炎症及组织损伤，在炎症反应中有重要作用［16-17］。IL-8是趋化因子家族的一员，有多重免疫调节功能，在囊性纤维化发病过程中起重要作用［18-20］。

本研究发现，白内障模型组大鼠血清中25羟维生素D水平降低，眼压较高；给药后血清中维生素D水平上升，眼压降低，即D-半乳糖诱导后，血清中25羟维生素D水平与眼压负相关。而且，随着血清中维生素D水平升高，可降低D-半乳糖诱导年龄相关性白内障的严重程度，诱导建模后血清中25羟维生素D水平与晶体浑浊情况负相关。血清中维生素D水平越低，LEC细胞凋亡率越高；给药后，血清中维生素D水平有较大程度的升高，LED凋亡程度降低，即诱导建模后血清中25羟维生素D水平与晶状体上皮细胞LEC凋亡呈负相关。此外，血清中25羟维生素D可抑制DPPⅡ、c-myc的表达，下调TNF-α、IL-8水平，且高剂量给药组抑制作用最强。血清中25羟维生素D可下调溶酶体蛋白酶DPPⅡ、原癌基因c-myc、癌细胞死亡因子TNF-α、炎症因子IL-8的表达，保护晶状体上皮细胞，延缓其凋亡，从而达到延缓年龄相关性白内障发生发展的作用。本研究结果表明，血清中25羟维生素水平与年龄相关性白内障的发生发展呈负相关，这可能与其下调DPPⅡ、cmyc、TNF-α、IL-8的表达有关。但是其具体的作用机制还需要进一步的探讨和研究。本研究提示，提高血清中25羟维生素D水平对年龄相关性白内障的预防及治疗有十分重要的意义，同时也为维生素D作为年龄相关性白内障病人保健药品的临床应用提供理论支持。

综上所述，血清中25羟维生素D水平与年龄相关性白内障的发展负相关，这对于白内障的预防及治疗有十分重要的意义。