藏红花素预处理减轻大鼠胃缺血再灌注损伤作用与PI3K/Akt信号通路的关系

徐曼秋，苏贞，甄玲玲，费素娟

作者单位：1徐州医科大学研究生学院，江苏 徐州 221002；2徐州医科大学附属医院消化内科，江苏 徐州 221002

胃缺血再灌注（GI-R）损伤是临床常见的组织器官损伤之一，常见于失血性休克、败血症、消化性溃疡进程中的出血、胃肠道缺血性疾病、器官移植等。目前认为其发生与氧自由基过量生成，血管内皮细胞和中性粒细胞间的相互作用，线粒体功能障碍，钙超载等多种因素有关。组织缺血再灌注损伤过程中各种因素联合作用，使得损伤逐渐加重，如不及时治疗，可能会导致组织坏死。因此寻找减轻缺血再灌注损伤的保护措施对于防治器官缺血再灌注损伤具有重要意义。

藏红花是一种鸢尾科番红花属的草本植物，藏红花素（crocin）是其主要成分，具有保护心肌、抗肿瘤、抗焦虑抑郁等作用［1］。研究发现crocin具有抗氧化作用，其可减少氧自由基的产生，诱导白血病细胞凋亡［2］。此外，藏红花可通过抑制细胞凋亡，减轻心肌缺血再灌注损伤［3］。因此，有必要探究crocin对胃缺血再灌注损伤的保护作用。本实验自2017年10月至2018年11月研究crocin对胃缺血再灌注损伤的保护作用及可能机制，从而为胃缺血再灌注损伤的防治提供新的思路和策略。

1 材料

1.1 实验动物健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量180～220 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号SCXK（鲁）2014 0007。大鼠每6只1笼，室温、昼夜节律条件下饲养，自由饮水摄食。实验前动物禁食24 h，不禁水。所有大鼠处置符合动物伦理学原则。

1.2 主要试剂藏红花素（crocin）购自Sigma公司，LY294002、TdT介导dUTP缺口末端标记（TUNEL）试剂盒、BCl-2、Bax、p-Akt抗体购自碧云天生物技术有限公司。PCNA小鼠单克隆抗体、超敏二步法免疫组化检测试剂、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥有限公司。丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其余试剂均为国产分析纯。crocin使用前用生理盐水配制成所需浓度，LY294002使用前用DMSO配制成所需浓度。

2 方法

2.1 实验分组取30只SD大鼠采用随机数字表法分为5组，每组6只。（1）假手术组（Sham组）：仅分离腹腔动脉，持续90 min；（2）胃缺血再灌注组（GI-R组）：无创动脉夹夹闭腹腔动脉缺血30 min后，松开动脉夹再灌注1 h；（3）溶剂对照组（Vehicle组）：注射生理盐水（NS）前10 min腹腔注射DMSO，缺血前30 min腹腔注射NS；（4）藏红花素预处理组（crocin组）：缺血前30 min，腹腔注射给药crocin（15 mg/kg），缺血30 min，再灌注1 h；（5）藏红花素预处理联合PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002组（crocin＋LY组）：crocin预处理前10 min，腹腔注射LY294002（20 mg/kg），缺血前30 min crocin预处理，缺血30 min，再灌注1 h。

2.2 胃缺血再灌注损伤模型建立参照Du等［4］方法并作相应改进。大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，剪毛消毒后于剑突下沿腹部正中线切开，用无齿平头镊把胃提出切口外，打开后腹膜，分离出腹腔动脉。用无创动脉夹夹闭腹腔动脉30 min后去除，恢复血流再灌注60 min。实验结束后取胃，沿大弯侧剪开，置于冰上展平，冰冷的NS冲洗干净，计算胃黏膜损伤指数。

2.3 胃黏膜损伤指数测定参照Du等［5］方法加以改进。以腺胃区局限于胃上皮的点状糜烂、溃疡、出血灶的长度累积计分：正常为0分，损伤小于1mm计1分，1～2 mm计2分，2～3 mm计3分，余类推。损伤宽度超过1 mm时分数加倍。每组大鼠损伤分数的平均值为损伤指数。

2.4 免疫组织化学染色法观察胃黏膜细胞增殖测量完损伤指数的胃沿胃小弯剪开，一半腺胃置于10%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，5μm切片，间断贴片于多聚赖氨酸处理的载玻片上备用。另一半腺胃在冰上快速剪取胃黏膜，置-80℃冰箱备用。免疫组化PCNA染色步骤按北京中杉金桥生物技术有限公司提供的超敏二步法免疫组化检测系统进行。DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。光镜下观察到胞核内有棕色颗粒者，即为阳性细胞。运用Image Pro Plus 6.0图像分析系统对阳性细胞进行半定量分析，以阳性细胞数占视野中细胞总数的百分比作为分析指标。

2.5 胃黏膜细胞凋亡的形态学检测胃组织石蜡切片（5 μm），常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。余下按TUNEL试剂盒说明书操作完成后，于光镜下观察到细胞完整、体积缩小固缩成团或形成凋亡小体、胞核呈棕黄色即凋亡阳性细胞。分析方法同上。

2.6 胃黏膜组织MDA含量和SOD活性测定取出已制备好的胃黏膜，用生理盐水制成10%的匀浆，每个标本取100 μL，用于胃黏膜组织MDA含量的测定。用生理盐水制成1%的组织匀浆，每个标本取30 μL，用于测定胃黏膜组织的SOD活力。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法，SOD活性测定采用羟胺法。严格按照试剂盒说明书操作。

2.7 Western Blot法检测胃黏膜组织Bcl-2，Bax，p-Akt蛋白的表达按Wang等［6］方法加以改进。将胃黏膜组织剪碎后，加入蛋白裂解液（每100 mg组织加1 mL裂解液）进行匀浆，匀浆后在4℃离心机离心后取上清即为蛋白提取液。己制备的蛋白提取液测蛋白浓度后，将各样品用匀浆液稀释至相同浓度，加入1/3体积的4×蛋白变性液95～100℃水浴变性5 min；将煮好的蛋白加入上样孔，保持每个孔所上的蛋白总量和体积一致；电泳结束后，以湿转移法转至PVDF膜上，加入3%BSA中室温封闭2 h；加入一抗（Bcl-2 1∶1 000、Bax 1∶500、p-Akt 1∶1 000），4℃孵育过夜。一抗孵育过夜后，1×TBST洗涤3次×10 min；分别加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，1×TBST洗涤3次×10 min后显色曝光。采用BandScan软件进行分析，以目的蛋白条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值反映蛋白表达水平。

2.8 统计学方法采用SPSS16.0软件进行分析，所得数据以±s表示。组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组胃黏膜损伤指数与Sham组相比，GI-R组胃黏膜损伤指数增加（P＜0.05）。与GI-R组相比，crocin组胃黏膜损伤指数降低（P＜0.05）。crocin+LY组较crocin组胃黏膜损伤指数增加（P＜0.05）。见图1。

图1 各组胃黏膜损伤指数

3.2 各组胃黏膜细胞凋亡情况与Sham组相比，GI-R组胃黏膜细胞凋亡率升高（P＜0.05）。与GI-R组相比，crocin组胃黏膜细胞凋亡率降低（P＜0.05）。crocin+LY294002组胃黏膜细胞凋亡率较单用crocin组升高（P＜0.05）。见图2，3。

图2 胃黏膜细胞的凋亡变化（TUNEL法，×400）：A为假手术组；B为胃缺血再灌注组；C为溶剂对照组；D为藏红花素预处理组；E为藏红花素预处理联合LY294002组

图3 胃黏膜细胞凋亡率的变化

3.3 各组胃黏膜细胞增殖情况与Sham组相比，GI-R组胃黏膜细胞增殖率降低（P＜0.05）。与GI-R组相比，crocin组胃黏膜细胞增殖率升高（P＜0.05）。crocin+LY294002组胃黏膜细胞增殖率较单用crocin组降低（P＜0.05）。见图4，5。

图4 各组胃黏膜细胞增殖情况（免疫组织化学，×400）：A为假手术组；B为胃缺血再灌注组；C为溶剂对照组；D为藏红花素预处理组；E为藏红花素预处理联合LY294002组

图5 胃黏膜细胞增殖率的变化

3.4 胃黏膜组织MDA含量、SOD活性的变化与Sham组相比，GI-R组胃黏膜组织MDA含量升高、SOD活性降低（P＜0.05）。与GI-R组相比，crocin组胃黏膜组织MDA含量降低、SOD活性升高（P＜0.05）。crocin+LY组胃黏膜组织MDA含量较单用crocin组升高、SOD活性降低（P＜0.05）。见图6。

3.5 各组胃黏膜组织Bcl-2、Bax蛋白表达情况与Sham组比较，GI-R组大鼠胃黏膜组织Bcl-2蛋白表达减少（P＜0.05），Bax蛋白表达增多（P＜0.05）。与GIR组相比，crocin组大鼠胃黏膜组织Bcl-2的表达增加（P＜0.05），Bax的表达减少（P＜0.05）。与单用crocin组比较，crocin+LY组胃黏膜组织Bcl-2的表达减少（P＜0.05），Bax的表达增加（P＜0.05）。见图7。

图6 胃黏膜组织MDA含量、SOD活性的变化：A为MDA含量变化；B为SOD活性变化

3.6 各组胃黏膜组织p-Akt蛋白表达情况与Sham组比较，GI-R组大鼠胃黏膜组织p-Akt蛋白表达增强（P＜0.05）。与GI-R组比较，crocin组p-Akt蛋白表达增加（P＜0.05）。与crocin组比较，crocin+LY组p-Akt蛋白表达减弱（P＜0.05），见图8。提示crocin对抗大鼠胃缺血再灌注损伤的保护作用可能与其上调PI3K/Akt信号通路活性有关。

图7 各组胃黏膜组织Bcl-2、Bax蛋白表达情况：A和B为Bcl-2蛋白表达情况；C和D为Bcx蛋白表达情况

4 讨论

机体组织器官正常代谢的维持以及功能与结构的完整性有赖于良好的血液供应。各种原因引起的局部组织器官缺血常会导致局部组织细胞代谢异常，造成不同程度的损伤。因而为阻止损伤进一步加重或促使其恢复，常需采取各种措施恢复血液灌注。实践证明，这种治疗方式在许多情况下取得了良好的效果。但大量的动物实验和临床观察中也发现，一定条件下恢复血液再灌后，部分动物或病人组织细胞缺血性损坏未减轻或恢复，反而进一步加重。研究发现，这可能与恢复血液供应后，氧自由基生成增多，清除减少，过量的氧自由基攻击组织内的细胞有关。生物膜上含有多种脂质，脂质中又含有各种不饱和脂肪酸，自由基可与脂肪酸发生反应，进行过氧化作用，导致膜的运输功能紊乱和丧失。而其中线粒体内膜最易受到氧自由基的攻击。氧自由基可诱发线粒体膜通透性转换孔开放，线粒体内膜外的小分子物质大量进入内膜，导致线粒体结构受损和功能紊乱，细胞色素C和凋亡诱导因子释放，激活下游凋亡级联反应［7］。氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。膜脂过氧化分解的终产物之一是丙二醛（MDA），因而测定MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。超氧化物歧化酶（SOD）是机体内清除氧自由基的特异性酶，其活性高低间接反映机体清除氧自由基的能力，因而其活性被认为是一种评估抗氧化能力的指标。多项研究表明crocin能减少细胞内氧自由基的产生，降低MDA的浓度［8］，增强SOD的活性［9］。本实验中，crocin组SOD活性较GI-R组升高、MDA含量降低。crocin＋LY组SOD活性较crocin组降低、MDA含量升高。表明crocin可增强胃黏膜组织的抗氧化能力和组织抗损伤的效应，而LY294002能抑制其抗氧化的作用。

图8 各组胃黏膜组织p-Akt蛋白表达情况：A为蛋白电脉图；B为各组线条图

PI3K/Akt信号通路是细胞内的重要信号转导途径，在细胞增殖、黏附、能量代谢、蛋白合成、促生存等过程中起重要作用［10］，酪氨酸激酶受体、非酪氨酸激酶受体、胰岛素受体等胞外信号可激活PI3K。Akt是PI3K信号通路中一个重要的下游靶点，PI3K的活化促使第二信使磷脂酰-3，4，5-三磷酸的形成从而进一步促进Akt的Thr308和Ser473位点磷酸化，进而激活 Akt［11］。激活的 Akt可通过抑制线粒体释放细胞色素C等凋亡相关因子、调节Bcl-2家族成员的活性等多种途径抑制细胞凋亡。

Bcl-2家族是影响细胞凋亡的一个关键调节因子，它包括抗凋亡蛋白（如：Bcl-2、Bcl-xl）和促凋亡蛋白（如：Bax、Bak、Bad）两类蛋白。研究发现，线粒体凋亡途径过度激活在缺血再灌注损伤中发挥重要作用，Bcl-2和Bax是调节线粒体途径细胞凋亡的重要分子。缺氧以及缺氧复氧能够增加Bax的表达并使其从胞质易位到线粒体，与Bcl-2的同源结构域结合形成异源二聚体，拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，增加线粒体膜对细胞色素C的通透性，启动细胞凋亡过程［12-14］。而Akt的激活可使Bax的Ser184位点磷酸化，使Bax与Bcl-2解聚，停留在细胞质中与Bcl-xl等形成异源二聚体，促进细胞存活［15］。本实验中，与GI-R组比较，crocin提高了p-Akt的蛋白表达，上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，下调促凋亡蛋白Bax表达，而LY294002可减弱crocin的该作用。说明crocin抑制胃黏膜上皮细胞凋亡、对抗GI-R损伤的作用可能与其上调PI3K/Akt信号通路活性有关。

综上所述，crocin减轻大鼠缺血再灌注损伤的作用机制可能与其通过上调PI3K/Akt信号通路活性，清除氧自由基，增强胃黏膜组织的抗氧化能力，上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，抑制细胞凋亡等有关。但其具体机制仍需进一步深入研究。

（本文图2，4见插图9-1）