体外法研究不同青贮菌、纤维分解酶及碳源组合青贮稻秸对瘤胃发酵参数及产气量的影响

■欧阳佳良 张 硕 戚如鑫 王梦芝

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009）

稻秸中含有丰富的粗纤维类碳水化合物，可作为反刍动物重要的饲料来源，但是稻草中粗蛋白含量低、适口性差，直接饲喂反刍动物，其采食量和饲料转化率都很低[1]。青贮技术通过乳酸菌分解秸秆中粗纤维类碳水化合物发酵生成大量的乳酸以及具有芳香气味的有机酸，可以提高饲料的营养价值和适口性[2]。但稻秸表面富含蜡质层和二氧化硅，自然附着乳酸菌少，不易制成优质的青贮饲料。添加剂能够提高稻秸的青贮品质，而且复合添加剂的青贮效果优于单一添加剂的使用[3]。郭海明等[4]曾报道同时添加青贮菌、纤维分解酶和碳源能最好的提升稻秸青贮品质。本课题组前期将3 种不同的青贮菌（地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌），3种纤维分解酶（黑曲霉、绿色木霉、纤维素酶）和3 种碳源物质（葡萄糖、麸皮、淀粉）采用L9(34)正交组合添加至稻秸的青贮中，结果表明添加剂对稻秸青贮品质和营养成分有很大的影响[5]。但是通过这些添加剂青贮出的稻秸饲料对反刍动物瘤胃发酵的影响尚不得而知。因此，本试验拟采用人工瘤胃发酵技术，将通过不同添加剂组合青贮的稻秸作为发酵底物，测定其产气参数与发酵参数。从而探究不同添加剂组合对青贮稻秸瘤胃发酵参数及产气量的影响，并筛选出最适合于稻秸青贮的添加剂组合。

1 材料与方法

1.1 试验动物及瘤胃液的采集

本试验在扬州大学实验农牧场选取4头身体健康、体况相近、安装有永久性瘤胃瘘管山羊，单圈饲养。燕麦草为粗饲料，同时补饲精料（60%玉米+40%豆粕），每日07：00和19：00等量饲喂，自由饮水。试验当天晨饲前，通过瘤胃瘘管，利用自制真空负压装置，从4只瘘管羊的瘤胃中抽取瘤胃液，混匀后经4层纱布过滤，滤液装入事先充满CO2并39 ℃预热的保温瓶中，带回实验室后置于39 ℃水浴锅中保温，并持续通入CO2以待接种。

1.2 试验材料与底物培养

在江苏省苏北农用稻田内收割的水稻秸秆（淮粳5号），鲜稻秸的含水量为63.55%，以风干基础计，稻秸中粗蛋白质含量为5.86%，中性洗涤纤维含量为71.63%，酸性洗涤纤维含量为40.54%。将秸秆均匀切成3～5 cm，混合均匀后取200 g 鲜样于30 cm×500 cm真空包装袋中，将添加青贮菌、纤维素分解酶溶于4 ml超纯水中，均匀喷洒在秸秆鲜样表面，再用真空机将真空袋抽成真空，于20～22 ℃下贮存。青贮发酵45 d 后采集样品，经65 ℃烘干制成风干样并粉碎过40目保存，以用作体外试验的发酵底物。

各组稻秸青贮所用添加剂组合及其发酵后的营养水平如表1所示。黑曲霉购于鹤壁市百惠生物科技有限公司。绿色木霉、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌及植物乳杆菌购于广州绿辉生物科技有限公司。麸皮、葡萄糖、淀粉购于国药集团药业股份有限公司。纤维素酶购于湖南鸿鹰祥生物工程股份有限公司。各添加剂的添加量均参照所购产品公司推荐最适宜青贮的添加量。青贮菌中地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌和粪肠球菌的添加量分别为12.0×107、8.0×105CFU/g和6.0×105CFU/g；纤维分解酶中黑曲霉、绿色木霉和纤维素酶的添加量分别为3.0×106、6.0×105CFU/g和60 U/g；碳源中葡萄糖、麸皮和淀粉添加量分别为20、20 mg/g和90 mg/g。

1.3 体外培养与样品采集

1.3.1 体外发酵批次培养试验

体外培养参照Cone等[6]的方法，配制人工唾液，将8.75 g碳酸氢钠(NaHCO3)、1.00 g碳酸氢铵(NH4HCO3)、1.43 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4）、1.55 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）、0.15 g七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）、0.52 g硫化钠（Na2S）、0.015 g 四水合氯化锰（MnCl2·4H2O）、0.002 g六水合氯化钴（CoCl2·6H2O）、0.012 g六水合氯化铁（FeCl3·6H2O）、0.017 g 二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）和1.25 mg 刃天青溶解在1 L 蒸馏水中，接种前在39 ℃水浴锅中预热并持续缓慢通入CO2直至pH值为6.8。将添加不同添加剂组合青贮的稻秸饲料作为发酵底物，分别称取500 mg于发酵瓶中，每组4个重复，另外增加4个空白对照（不加底物）。将50 ml人工唾液和25 ml 瘤胃液迅速注入发酵瓶中，并向瓶内持续通入CO2约5 s，立即旋紧瓶塞，在SHA-A型恒温震荡水浴锅中39 ℃恒温震荡培养。培养72 h后将发酵瓶取出置于冰水浴中，停止发酵，立即测定培养液pH值，取培养液样品经4 层纱布过滤后分装于离心管中置于-20 ℃冷冻保存，用于氨氮（NH3-N）浓度、微生物蛋白（MCP）和挥发性脂肪酸（VFA）的测定。

表1 稻秸添加剂组合及其发酵后的营养水平(干物质基础，%)

1.3.2 体外发酵产气试验

体外发酵的底物、人工唾液及瘤胃液按照上述准备并添加至发酵瓶中，每组设6 个重复，另外增加6 个空白对照。持续通入CO2约5 s 后立即盖上橡皮塞，将发酵瓶与64路AGRS-Ⅲ型体外发酵产气自动记录装置的气路相连接，在39 ℃恒温下连续培养72 h。

1.4 体外发酵指标测定

1.4.1 体外发酵参数的测定

培养液pH 值采用上海雷磁试验设备厂pHS-3C型pH计测定。NH3-N浓度参照冯宗慈等[7]的方法进行测定，采用756型可见紫外分光光度计测定546 nm的吸光度值(OD546nm)。瘤胃微生物蛋白(MCP)浓度采用苏海崖[8]的方法测定。挥发性脂肪酸浓度采用Wang等[9]的方法用气相色谱测定。先将培养液经15 000×g 离心10 min 后取上清液1 ml 加0.2 ml 20%含60 mmol/l巴豆酸（内标物）的偏磷酸，混匀后再次离心取上清液0.4 μl 采用气相色谱（GC-17A，日本岛津公司）测定VFA 浓度。总挥发性脂肪酸（TVFA）浓度为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸浓度之和。

1.4.2 产气量和产气参数的计算

参照Ørskov 等[10]提出的公式模型对各组的产气量数据进行非线性回归拟合：

GPt=a+b×(1-e-ct)

式中：GPt——t时间点的累积产气量（ml/g DM）；

a——快速产气部分，即发酵初始时间点的产气量（ml/g DM）；

b——缓慢产气部分，即理论最大产气量(ml/g DM);

c——体外发酵产气速率常数（ml/h）；

a+b——潜在产气量（ml/g DM）。

1.5 统计分析

采用Excel 2016对试验原始数据进行整理，采用SPSS16.0 进行单因素方差分析和Duncan's 进行多重比较。P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同添加剂组合对青贮稻秸体外发酵pH 值、NH3-N和MCP浓度的影响

表2 中，除9 组以外，各组pH 值一直维持在6.0～7.0之间，且各组之间没有显著性差异（P＞0.05）。5、9组中NH3-N浓度显著高于其他组，而1组NH3-N浓度显著低于其他组（P＜0.05）。对照组MCP 浓度显著低于其他各组，而3组和8组MCP浓度最高（P＜0.05）。

表2 体外模拟瘤胃发酵pH值、NH3-N浓度和MCP含量

2.2 不同添加剂组合对青贮稻秸体外发酵挥发性脂肪酸（VFA）浓度的影响

由表3 可知，对照组和1 组TVFA、乙酸、丁酸、异戊酸和戊酸的含量都显著低于其他组（P＜0.05），且对照组和1 组的丙酸和异丁酸含量也很低，但1 组的TVFA、乙酸、丙酸、丁酸、和戊酸都显著高于对照组。3组的TVFA、丙酸和丁酸显著高于其他组，除4和9组外，3组的乙酸浓度也显著高于其他组（P＜0.05）。9组乙丙比显著高于其他组，而1组乙丙比显著低于其他组（P＜0.05）。

表3 体外模拟瘤胃发酵VFA浓度测定

2.3 不同添加剂组合对青贮稻秸体外发酵产气量的影响

由表4 可知，对照组发酵累积产气量、理论最大产气量、潜在产气量和产气速率常数都显著低于其他组（P＜0.05），而3组累积产气量、理论最大产气量和潜在产气量都显著高于其他各组（P＜0.05）。9组产气速率常数最高，且除3组外，9组累积产气量显著高于其他组（P＜0.05）。

表4 不同添加剂对青贮稻秸体外产气量的影响

3 讨论

3.1 不同添加剂组合对青贮稻秸体外发酵pH 值、NH3-N和MCP浓度的影响

瘤胃pH值是瘤胃内环境的重要指标，最适合瘤胃微生物生长繁殖的pH值范围为6.0～7.0[11]。本试验中，各组pH值之间没有显著性的差异，说明不同添加剂组合对青贮稻秸体外发酵pH值没有影响。NH3-N能够为微生物提供18%～100%的氮源，是瘤胃微生物生长所需要的主要氮源[12]。NH3-N还能在一定程度上反映出瘤胃微生物对饲料中含氮物质的分解与利用情况，其在瘤胃内的浓度不宜过高或过低，有研究表明，瘤胃微生物生长的最适NH3-N浓度为5～28 mg/100 ml[13-14]。本试验中，所有组别的NH3-N 浓度都在适宜的范围内，但5、9组NH3-N浓度显著高于其他组，可能是因为5、9组底物中蛋白含量较高，促进了瘤胃微生物对饲料中含氮物质的降解。MCP是反刍动物最主要的蛋白质供应者，能提供反刍动物蛋白质需要的40%～80%[15]。饲粮的类型、瘤胃微生物的数量以及瘤胃内氮源和能量的有效同步都会影响瘤胃内MCP 的浓度[16]。本研究中，对照组MCP浓度显著低于其他各组，而3组和8组MCP浓度最高。说明添加剂能够提高青贮稻秸体外发酵MCP浓度，并且以3组和8组的效应最佳。

3.2 不同添加剂组合对青贮稻秸体外发酵VFA浓度的影响

反刍动物瘤胃微生物通过降解饲粮中的碳水化合物继而发酵产生VFA，作为反刍动物主要的能量来源[15]。VFA 的比例和浓度与饲粮中纤维类物质含量有很大联系，瘤胃液中的TVFA 随饲粮中的纤维含量提高而降低[17]。还有研究报道，瘤胃液中乙酸的浓度与饲粮中NDF 含量呈高度的正相关[18-19]。本试验中，对照组TVFA 的浓度最低，说明青贮添加剂能够降低稻秸中粗纤维的含量，从而提高TVFA 浓度。处理中1、2、7、8组的TVFA也较低，说明1、2、7、8组的青贮稻秸纤维含量较高，青贮品质较差。然而，3 组的TVFA、乙酸、丙酸和丁酸含量都很高，说明3组添加剂组合的方式能够最好的提升稻秸的青贮品质。除3 组外，9 组中乙酸浓度及乙丙比都较高可能是因为9 组青贮稻秸中NDF 含量较高，而NDF 在维持瘤胃内环境稳态及其功能方面发挥着重要作用[20]。

3.3 不同添加剂组合对青贮稻秸体外发酵产气量的影响

饲料的体外发酵产气量可以反映饲料在瘤胃中的可发酵程度，瘤胃微生物的数量，降解能力以及发酵底物的自身特性共同决定饲料体外发酵的产气量[21]。体外发酵的累积产气量与发酵底物饲料中的NDF含量呈负相关，而与饲料中的CP含量呈正相关[22]。青贮饲料在发酵过程中，乳酸菌不仅可以利用饲料中可溶性碳水化合物发酵生成乳酸，还可以消化饲料中的含氮物质发酵生成菌体蛋白，提高青贮饲料中的CP含量[23]。纤维分解酶可以分泌降解纤维素、木质素的酶类降解青贮饲料中的NDF、ADF类碳水化合物，从而为乳酸菌提供发酵底物[24]。所以，青贮饲料的品质直接影响青贮饲料的体外发酵产气量。本试验中，处理组的发酵累积产气量、理论最大产气量、潜在产气量和产气速率常数都显著高于对照组，再次说明青贮添加剂能够提高稻秸的青贮品质。且3组累积产气量、理论最大产气量和潜在产气量都显著高于其他各组，说明3组的添加剂组合能够最好的提高稻秸的青贮品质及其营养价值。

4 结论

综合体外发酵参数和产气量的结果表明，青贮添加剂能够通过提高稻秸的青贮品质及其营养水平从而提高青贮稻秸体外发酵性能，其中3组(即地衣芽孢杆菌+纤维素酶+淀粉)效果最好。