包被精油复合酸化剂对断奶仔猪生长性能、肠道免疫及盲肠微生物的影响

■蒋 志 付 饶 郑达文 周响艳 战晓燕 董泽敏 冯定远 左建军*

(1.华南农业大学动物科学学院，广东广州510642；2.厦门德福仁生物技术有限公司，福建厦门361000；3.上海农林职业技术学院动物科学技术系，上海201699)

仔猪早期断奶时母子分离，随后转入新的栏舍与其他非同窝的猪混群并通过打斗建立社会分级；采食日粮由液态转变成固态。这些相互联系的应激因素导致仔猪肠道稳态的不平衡，尤其是突然的断奶会导致肠道形态学上的改变、内分泌失调和免疫系统受损[1]。这些都会导致仔猪转栏后短期拒食，完全饥饿后再大量采食，由此导致胃肠道内pH 值偏高[2]，无法有效抑制仔猪从环境或饲料中采食到的有害微生物的生长[3]。而酸化剂理论上可以有效的降低饲料pH值，帮助仔猪避免断奶时期胃肠道内pH 值偏高的问题。近年来通过大量的试验研究表明，在动物日粮中添加一定量的酸化剂，具有调控动物肠道微生物平衡、增殖有益菌、抑制有害菌、降低肠道pH值、提高动物免疫力等功能。此外，酸化剂不污染环境、无残留等优良的特性，被称作新型饲料添加剂，具有广阔的应用前景[3-5]。单酸化剂或者复合酸化剂添加到饲料中的研究已经很多了。但是把酸化剂同植物精油一同包被起来，应用在断奶仔猪生产上，以提高畜体后小肠健康的产品的文章在国内几乎没有报道。本文通过研究断奶仔猪生长性能、免疫相关指标和盲肠微生物绝对数量，为包被精油复合酸(MEA)类产品的开发与应用提供更全面的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用MEA均为植物氢化脂肪作为微囊外壳包被柠檬酸、山梨酸、百里香酚以及香兰素，共45%的活性成分。MEA1 为肇庆市某猪场自用，MEA2 由厦门某公司提供。饲养试验在肇庆市某猪场进行。

1.2 试验动物及日粮

试验动物选用250 头健康(21±3)日龄“杜×(长×大)丹系”三元杂交猪，基础日粮为玉米-豆粕型商业日粮，其组成及营养水平见表1。

1.3 试验设计与饲养管理

选择体重5.5 kg 左右的杜长大丹系三元杂交猪250 头仔猪，按饲养试验要求随机分为5 组，每组设5 个重复，每个重复10头猪，公母各半，分别饲喂基础日粮（BASE 组）、基础日粮+ 0.05% MEA2（LA 组）、基础日粮+0.08% MEA2（MA组）、基础日粮+0.2% MEA1（HA 组）、基础日粮+0.2% MEA1+0.05% MEA2（BHA组）。试验期间猪只自由采食，自由饮水。试验预试期3 d，正试期为21 d 期间兽医和疫苗程序遵循试验场自行的规章制度进行。试验期间记录每个重复的料耗，饲养试验结束时，禁食（自由饮水）12 h后称重，计算试验猪的日平均采食量、日增重和料重比。

1.4 屠宰试验

饲养试验结束后，从每个重复中选体重相近的猪各5头，共25头，在禁食（自由饮水）12 h后进行屠宰。

1.5 样品收集

试验结束后每个重复随机选择1头、每个处理组5 头仔猪屠宰，共25 头，每头样本仔猪被电击至晕后，无菌采集静脉血10 ml 注入不加肝素钠的采血管内，样品置于常温2 h，待血液凝固后分离血清，血清-20 ℃保存，用于分析白介素2（IL-2）以及免疫球蛋白（IgG）。准备无菌的10 ml离心管数只，待屠宰仔猪静脉放血后剖腹，以胃幽门末端开始有胰腺附着的肠道即为十二指肠，十二指肠向后肠道延伸两米即为空肠中段，盲肠向前肠道一米即为回肠中段。对十二指肠、空肠中段、回肠中段、盲肠用棉线两头结扎。在各肠道中部先取肠道组织样，然后在各肠中部用10 ml 离心管收集10 g 左右食糜液氮速冻，带回实验室-80 ℃冰箱保存。

表1 基础日粮组成和营养水平(风干基础)

1.6 生长性能指标测定

①平均日采食量(ADFI)：一共25个栏，以每一栏为一个单位准确记录总饲喂量，最终计算各试验组平均日采食量。平均日采食量（g）=（投料总量-剩料量）/（试验猪数×饲喂天数）

②平均日增重(ADG)：以栏为单位，试验开始时做好仔猪21 日龄的称重，并记录好45 日龄仔猪的称重，称重前夜21：00 不喂料，隔天早上8：00 开始称重。所得初重、末重计算各试验组的总增重和平均日增重。平均日增重（g）=（平均末重-平均初重）/饲养天数

③饲料转化效率(F/G)：指每头仔猪体重增加1 kg所需要的日粮重量，是评价其饲料利用率的重要指标。饲料转化效率(F/G)=ADFI/ADG

④脏器指数(g/kg)=内脏重量(g)/宰前活重(kg)

1.7 肠道pH值测定

在采样时直接用DELTA320 梅特勒—托利多pH仪器测定，取各肠道中部样品测定pH值。

1.8 免疫相关指标的测定

本次试验采用南京建成血清白介素2（IL-2）血清免疫球蛋白G（IgG）、分泌型免疫球蛋白A（SlgA）ELISA 试剂盒进行分析测定，严格按照试剂盒使用说明书操作执行。总RNA 抽提使用Trizol 法，使用Takara 逆转录试剂盒获取cDNA，然后用ABI7500 实时荧光PCR 定量仪器及SYBRGreen 染料体系对所得cDNA 进行基因表达强度测定，所得结果按照2-△△Ct方法计算，选取乳酸脱氢酶（GAPDH）为内参基因，紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin）、白介素10（IL-10）为目的基因，各基因上下游引物及PCR 反应参数见表2。

1.9 盲肠食糜微生物的定量检测

采样北京天根生物科技有限公司粪便微生物DNA 提取试剂盒。得到盲肠粪便DNA 后，使用ABI7500 实时荧光PCR 定量仪器及SYBRGreen 染料体系根据用各目的菌基因的纯化PCR 产物以Lg（拷贝数）为X 轴，以CT 值为Y 轴制作标准曲线，再根据标准曲线和各重复目的菌的CT值套入标准曲线内得到绝对细菌数，默认一个菌等于一个拷贝数。拷贝数计算公式为：拷贝数=(C×6.023 3×1023copies/mol)/（S×660×106）。公式中的C 表示标准品浓度，单位μg/μl，S 表示待测细菌基因组DNA 的定量PCR 产物的碱基数。所用引物由上海生物工程有限公司合成，用梯度PCR仪器摸索各基因最佳退火温度，各基因上下游引物及PCR反应参数见表2。

GAPDH、Occludin、ZO-1、IL-10 引物设计参考Chen 等(2018)[6]发表的文章，总菌、大肠杆菌、沙门氏菌、乳酸杆菌、双歧杆菌引物设计参考Zhang 等(2016)[7]发表的文章。

1.10 数据处理

结果以“平均值±标准误”表示，数据处理与分析采用SPSS20.0软件,用单因素方差分析和一元线性回归分析处理试验数据，以P＜0.05作为差异显著性判断标准，以0.05＜P＜0.10作为差异有趋势判断标准。

2 试验结果

表2 各基因引物序列

2.1 断奶仔猪生长性能

见表3 可见，各组间日增重、日采食量和料重比无明显变化（P＞0.05）。

2.2 断奶仔猪内脏器官相对重量

表3 MEA对断奶仔猪生长性能的影响

由表4 可见，LA、MA 组肝脏指数显著低于BASE组（P＜0.05）。

2.3 肠道pH值

由表5 可见，空肠MA 组pH 值有高于LA 组趋势（P=0.06），回肠BASE、LA 组、MA 组显著高于BHA 组（P＜0.05），其余部位组间无显著差异(P＞0.05)。

表4 MEA对断奶仔猪脏器指数的影响(g/kg)

表5 MEA对断奶仔猪肠道pH值的影响

表6 回肠pH值与MEA的一元线性回归分析

由表6 可见，对回肠pH 值与MEA 添加量进行一元线性回归，回肠pH值与MEA添加量相关性为极显著（P＜0.01），回肠pH值与MEA回归系数极显著（P＜0.01）。

2.4 免疫相关指标

图1 MEA对断奶仔猪血清免疫球蛋白(IgG)的影响

图2 MEA对断奶仔猪血清白介素2(IL-2)的影响

图3 MEA对断奶仔猪空肠分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的影响

由图1 可知，血清免疫球蛋白G：LA 组有低于BASE组的趋势（P=0.083），MA组有高于LA组的趋势（P=0.069），MA组显著高于HA组（P＜0.05）。由图2可知，各组间血清IL-2含量无显著差异（P＞0.05）。由图3 可知，各组间空肠SIgA 分泌量无显著差异（P＞0.05）。由图4 可知，各组间回肠Occludin 基因mRNA相对表达量无显著差异（P＞0.05）。由图5可知，ZO-1基因相对表达量：MA 组较BASE 组显著上调（P＜0.05），MA组基因较BHA组显著上调（P＜0.05）。由图6可知，IL-10基因相对表达量：MA组较BASE组有上调的趋势（P=0.092）。

图4 MEA对断奶仔猪回肠紧密连接蛋白（Occludin）基因相对表达量的影响

图5 MEA对断奶仔猪回肠紧密连接蛋白（ZO-1）基因相对表达量的影响

图6 MEA对断奶仔猪回肠白介素10（IL-10）基因相对表达量的影响

2.5 盲肠微生物

由表7 可见，双歧杆菌：MA 组有高于对照组的趋势(P=0.066)，MA 组显著高于LA 组（P＜0.05），其他各菌种、各组间无差异（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 MEA对断奶仔猪生长性能的影响

表7 MEA对断奶仔猪盲肠微生物的影响

经历过早期断奶的仔猪，由于其消化系统尚未成熟，神经和内分泌对于消化系统的调控不是很完善，因此断奶后胃肠道pH 值较同日龄的哺乳仔猪会升高。断奶应激下胃肠道pH 值偏高会导致后肠道大肠杆菌数量增加、沙门氏菌等酸敏感有害菌大量生长从而导致腹泻[4，8]。在生产实践中一般选用抗生素添加到饲料中从而达到抑菌促进生长的作用，随着抗生素在饲料中添加的进一步被限制，我们选择了利用包被酸化剂降低后肠道pH 值且配伍植物精油，用于灭杀动物后肠道内的有害微生物，进而保护动物的后肠道健康。在本次试验中，虽然LA、MA 组肝脏指数均显著低于BASE 组（P＜0.05），但无论是MEA1 还是MEA2 的添加都没有对试验猪只的生长性能起到显著作用(P＞0.05)。结果与张玲玲(2018)[9]、Cho 等(2015)[10]等的实验结果一致，即在有抗生素的情况下添加0.2%、0.3%、0.5%和1%的MEA 与抗生素组相比，生长性能无差异。与抗生素组相比肉鸡饲粮添加0.15%、0.20%、0.25%MEA 对肉鸡生长性能、免疫器官指数也无影响[11]。但当断奶仔猪试验天数延长到22 周时，在饲料中添加0.1%或0.2%的MEA较对照组相比平均日增重、平均日采食量和饲料效率比均显著提高[12]。这给了我们两个提示，一个是在断奶仔猪阶段MEA 与抗生素的对比无显著差异，其可能的提高肠道健康的功能无法直接显示到生长性能数据上，若把试验期延长到育肥阶段，MED 的保护肠道健康的功能可能会显现出来；第二个是MEA或许可以作为一种添加到中大猪饲料中的绿色促生长剂。

3.2 MEA对断奶仔猪肠道pH值的影响

饲用酸化剂的重要理论目标即为降低畜体胃肠道pH值。而相关产品在使用时往往会因为酸化剂种类特性、配伍比例、是否包被以及添加量等因素影响着试验结果。Piva等（2007）[4]用包被的香草醛混合山梨酸（MBP）和未包被的香草醛混合山梨酸（NBP）饲喂断奶仔猪，发现两组间香草醛或山梨酸浓度在胃内没有差异。而NBP 组在空肠检出的山梨酸和香草醛浓度与胃内的相比显著减少，同时MBP 组肠道中香草醛或山梨酸浓度显著高于NBP 组。Gomes 等（2011）[13]用富马酸、乳酸、丙酸钙联用进行了断奶仔猪试验，结果对于胃和空肠的pH 值没有观察到处理之间的显著差异。朱宇旌等（2012）[14]在肉鸡基础日粮中分别添加0.03%的由富马酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸为活性单位的包被有机酸，和0.05%包被有机酸，发现各组胃肠道pH值差异不显著。而晏家友（2009）[3]用延胡索酸、乳酸、柠檬酸和苹果酸组成的0.05%到0.2%的包被酸化剂无论是和抗生素组比还是非抗生素组的基础日粮相比均显著降低了断奶仔猪胃和小肠的pH 值，许丽惠等（2016）[15]用柠檬酸、乳酸、磷酸组成的0.3%及0.5%包被酸化剂饲喂黄羽肉鸡观测到十二指肠、腺胃pH 值显著低于对照组。本试验结果显示，随着MEA 化剂总添加量的增加，断奶仔猪胃、十二指肠、空肠pH值均无显著变化（P＞0.05），但在回肠部位BHA组pH值显著低于BASE组、LA组、MA组（P＜0.05），且回肠部位BHA 组pH 值也比HA 组低了5.65%（P＞0.05），根据一元线性回归分析结果所示，随着总MEA在饲料中添加量的增加，回肠pH值逐渐降低（P＜0.01）。

由此可见，酸化剂的不同配伍、包被技术以及添加量会直接影响到试验结果，本次试验用MEA 均为氢化脂肪微囊包被，在动物体内经脂肪酶水解包被材料，主要在动物后小肠释放。因此试验数据观测到在胃、十二指肠、空肠pH 值均无显著变化，但显著降低了回肠的pH值（P＜0.05)，且在0～0.25%的区间有剂量依赖效应（P＜0.01）。

3.3 MEA对断奶仔猪免疫力的影响及其机理

动物在采食时，会不断地从饲料或者饮水中摄入病原体，这部分病原体直接面对的就是畜体的胃肠道。紧密连接蛋白ZO-1和Occludin位于肠上皮细胞间隙，可通过旁细胞途径调节肠溶质和水进出肠细胞[16]，他们是肠道本身的物理防御屏障结构蛋白，当他们表达量降低时可说明细胞间紧密连接的状态变差，因此ZO-1、Occludin 基因的mRNA 相对表达量可以用来作为肠道健康的指标[17-18]。当病原体“定植”在肠道黏膜上进而侵染畜体或在畜体肠道内营寄生生活时，动物肠道作为最大的能起到免疫功能的器官会通过一些炎症反应来产生特定的抗体清除掉肠腔内的病原体。为此我们挑选了血清促炎因子IL-2和与紧密连接蛋白表达相关的抑炎因子IL-10[5]，具有中和病原菌毒素能力的抗炎因子SIgA[19]以及大家公认的血清IgG 免疫球蛋白来综合评价断奶仔猪肠道免疫能力。本次试验各组间血清IL-2，回肠Occludin mRNA 相对表达量与空肠SlgA 差异均不显著(P＞0.05)。但血清IgG在BASE组基础上添加0.08%MEA2的MA 组较添加0.2%MEA1 的HA 组显著增加；较添加0.05%MEA2 的LA 组有升高的趋势（P=0.069）。结果与Han 等（2019）[20]用MEA 作为饲料添加剂从断奶仔猪阶段一直饲喂到育肥猪阶段发现MEA组血清免疫球蛋白G显著增加；孙代鹏等（2018）[21]在断奶仔猪饲料中添加肉桂醛和百里香酚组可以提高仔猪血清中IgG 水平；王宇（2017）[5]在断奶仔猪饲料中添加1%的绿原酸血清免疫球蛋白G 含量较0.25%绿原酸组显著升高(P＜0.05)，与王亚男（2017）[19]的对照组、抗生素组、0.2%包被精油组之间小肠IL-10mRNA 相对表达量无显著差异，空肠SlgA 精油组与对照组相比差异显著略有差异，但本次结果回肠SlgA 在数值上也是随着MEA 的添加而增加，但结果不显著（P＞0.05）。可见在断奶仔猪饲粮中添加0.08%的MEA2可能会通过促进血清IgG 的分泌进而起到提升其体液免疫力的作用。

有研究者用轮状病毒对断奶仔猪攻毒，18天后检测到小组回肠黏膜中闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)的表达量显著降低了(P＜0.05)[22]。类似的，王若瑾（2013）[23]用双氧水建立大鼠应激模型后发现对照组大鼠肠道Occludin mRNA 相对表达丰度极显著的高于应激组(P＜0.01)，而止痢草油组显著高于应激组(P＜0.05)，ZO-1 mRNA相对表达丰度应激组和OEO组均显著低于对照组(P＜0.01)；Yan等（2018）[24]总结，被大肠杆菌K88 感染的仔猪肠道ZO-1 表达量显著降低，而用丁酸梭菌预处理处理的仔猪肠道ZO-1蛋白表达显著增加。这似乎预示着当动物体在受到病毒、氧化应激或致病性细菌的侵袭时，其紧密连接蛋白会遭到破坏，而高的紧密连接蛋白相对表达量对于健康畜体抵抗病原体是有益的。本次试验中MA组回肠IL-10基因相对表达量较BASE组有上调的趋势（P=0.094），MA 组回肠ZO-1 基因相对表达量较BASE 组、BHA 组显著上调（P＜0.05）。有研究者用未包被的有机酸添加到饲料中发现小肠ZO-1、Occludin无差异[5]。说明对精油或有机酸进行包被还是有必要的，MEA2在BASE组中添加量为0.08%时可以提高肠道ZO-1mRNA基因相对表达量；IL-10基因相对表达量结果趋势亦相同，说明MEA2 添加量在0.08%时有提高肠道物理屏障免疫能力的趋势。但是BHA的较MA 组相比ZO-1mRNA 基因相对表达量降低（0.05＜P＜0.10），说明本次试验用MEA 的总添加量不宜达到0.45%。

3.4 MEA对断奶仔猪盲肠微生物的影响及其机理

在养殖条件下畜体在出生后，其肠道内主要优势菌为双歧杆菌等厌氧菌，但断奶应激会破坏该菌群的动态平衡，使大肠杆菌、肠球菌等兼性厌氧菌等占优势，随着发育的成熟，厌氧菌再重新占据优势[25]。在断奶期间给仔猪肠道内投放一定量酸化剂和精油或许可以抑制有害菌的生长，而促进肠道正常菌群的尽早建立。Piva等（2007）[4]拿用氢化脂肪包被（PB）和未包被（NPB）的香草醛混合山梨酸饲喂断奶仔猪，发现在盲肠和空肠末端PB比对照组大肠杆菌数更少。朱宇旌等（2012）[14]用0.05% MEA 组盲肠双歧杆菌数量极显著高于其他各组(P＜0.01)，有文章表明在断奶仔猪日粮中添加香芹酚、肉桂醛和辣椒油与甲酸混合的添加剂，改变了盲肠和结肠中的挥发性脂肪酸谱，进而有效改变胃肠道生态系统[26]。本试验MA组盲肠大肠杆菌和沙门氏菌只有在数值上低于BASE 组，并没有达到差异显著，但MA 组盲肠双歧杆菌有高于BASE的趋势(P=0.066)、MA组盲肠双歧杆菌显著高于LA 组。说明MEA2 在断奶仔猪日粮中添加量为0.08%时可能通过促进双歧杆菌这一类完全厌氧菌的生长，进而达到对大肠杆菌、沙门氏菌等兼性厌氧菌的抑制效果。

4 结论

①饲料中添加包被精油复合酸化剂2 可以显著降低断奶仔猪肝脏指数。

②饲料中添加包被精油复合酸化剂可以显著降低断奶仔猪回肠pH值，且有剂量依赖效应。

③饲料中添加0.08%的包被精油复合酸化剂2有增加断奶仔猪免疫力的趋势。

④饲料中添加0.08%的包被精油复合酸化剂2可以改善断奶仔猪盲肠微生物菌群结构。