高效液相色谱法测定日用香精中的10种香豆素及其衍生物含量

朱惠斌，王雪平

（1．黄河水利职业技术学院，河南开封475004；2．开封市绿色涂层材料重点实验室，河南开封475004）

香豆素及其衍生物是一类具有芳香性气味的物质，广泛存在于芸香科、伞形科、菊科、豆科、瑞香科、茄科等高等植物及微生物的代谢产物中［1－4］。通常在化妆品中添加一定量的日用香精（由日用香料和辅料按一定配方调制而成的混合物），以赋予其温馨、优雅的香气。但香豆素及其衍生物可能被添加在香水、沐浴啫喱、除臭剂等化妆品中。国际日化香料协会不推荐具有致敏作用的二氢香豆素、7－甲基香豆素、7－甲氧基香豆素等化合物作为日用香料成分使用；我国化妆品安全技术规范也明确规定环香豆素、4－甲基－7－乙氧基香豆素、7－甲氧基香豆素、7－甲基香豆素、二氢香豆素等香豆素及其衍生物为化妆品中的禁用物质［5－8］。

目前香豆素及其衍生物测定方法主要有气相色谱法（GC）［9］、高效液相色谱法（HPLC）［10］、液相色谱－串联质谱法（LC－MS／MS）［11－12］。本文采用碱性甲醇超声提取香豆素及其衍生物，提取物采用Phenomenex Luna C18柱分离，以乙腈和0．1%NH4Ac溶液为流动相进行梯度洗脱，二极管阵列检测器同时在280 nm、306nm和320nm波长检测，建立了高效液相色谱法同时测定日用香精中10种香豆素及其衍生物的含量，为香豆素及其衍生物等禁用物质的监督检测提供技术支持。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

LC－20A型液相色谱仪（日本，岛津公司），附二极管阵列检测器（DAD）；JN－B－50型分析天平（上海圣科仪器设备有限公司）；YQ－1000C型超声波清洗器（上海易净超声波仪器有限公司）；5427R型高速冷冻离心机（德国，Eppendorf公司）；ULUP－Ⅱ型超纯水器（西安优普仪器设备有限公司）。

香豆素及其衍生物标准品：香豆素（CM）、二氢香豆素（DDCM）、双香豆素（DCM）、4－羟基香豆素（HOCM）、6－甲基香豆素（6MCM）、7－甲基香豆素（7MCM）、7－甲氧基香豆素（7MOCM）、7－乙氧基－4－甲基香豆素（EMCM）、醋硝香豆素（SCM）和环香豆素（PCM），纯度均≥98%，上海安谱实验科技股份有限公司。香豆素及其衍生物标准储备液：准确称取各香豆素及其衍生物标准品适量（精度0．1mg），用甲醇溶解配制浓度为10．0mg／mL的标准储备液，－18℃保存。香豆素及其衍生物标准混合工作液：分别准确移取各香豆素及其衍生物标准储备液各1．0mL于50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，该溶液中10种香豆素类化合物的浓度均为200μg／mL，4℃保存。甲醇、乙腈均为色谱纯，美国Tedia公司；HAc、NaOH为分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。实验用水为超纯水。

1．2 液相色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18柱（250×4．6mm，5μm）；流动相 A：乙腈；流动相B：0．1%NH4Ac溶液；流速：1．0mL／min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：280nm（香豆素、二氢香豆素、4－羟基香豆素、6－甲基香豆素、7－甲基香豆素），306nm（双香豆素、环香豆素、醋硝香豆素）、320nm（7－甲氧基香豆素、7－乙氧基－4－甲基香豆素）。流动相梯度洗脱条件：初始条件80%B；0～40．0min，80%～65%B；40．0～50．0min，65%～30%B；50．0～56．0min，30%B；56．0～60．0min，80%B。

1．3 样品前处理

称取化妆品样品2g（精度0．1mg）于10mL容量瓶中，加入6mL甲醇（含0．5%NaOH），涡旋振荡30s，超声提取20min，放至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀。转移至15mL具塞塑料离心管中，10 000r／min离心5min，上清液经0．22μm滤膜过滤，滤液供HPLC测定。

2 结果与讨论

2．1 检测波长的选择

分别扫描10种香豆素及其衍生物标准溶液在190～800nm波长范围紫外吸收光谱。结果表明：香豆素、二氢香豆素、4－羟基香豆素、6－甲基香豆素、7－甲基香豆素在280nm波长处，有最大吸收波长；双香豆素、环香豆素、醋硝香豆素在306nm波长处，有最大吸收；7－甲氧基香豆素、7－乙氧基－4－甲基香豆素在320 nm波长处，有最大吸收。通过对实际样品加标实验发现，在280nm、306nm和320nm处检测干扰峰较少，且其吸光度值与香豆素及其衍生物的含量呈正比关系，因此确定采用280nm、306nm和320nm作为检测波长。

2．2 色谱柱及流动相的选择

分别考察了 Waters Symmetry C18、Agilent XDB C18、Inertsil ODS C18、Phenomenex Luna C18、Diamonsil C18色谱柱对香豆素及其衍生物的分离效果。结果表明：采用Phenomenex Luna C18柱（250×4．6mm，5μm）时，10种香豆素及其衍生物的色谱峰分离效果好，且色谱峰响应值较高，峰形对称，无拖尾现象。实验分别考察甲醇／乙腈－水、甲醇／乙腈－磷酸缓冲液、甲醇／乙腈－NH4Ac溶液等不同流动相体系。结果表明：采用甲醇－水、甲醇－磷酸缓冲液、甲醇－乙酸铵为流动相时，基线漂移严重，色谱峰不能实现有效分离；采用乙腈－水作为流动相时，基线较平稳，色谱峰响应值较高，但双香豆素、醋硝香豆素和4－羟基香豆素色谱峰拖尾；采用乙腈－0．1%NH4Ac溶液作为流动相，梯度洗脱，香豆素及其衍生物分离效果较好，各色谱峰响应值较高。因此选择乙腈－0．1%NH4Ac溶液作为流动相。优化色谱条件见1．2节，所得色谱图见图1。

图1 香豆素及其衍生物标准溶液的色谱图Fig．1 Chromatograms of coumarin and its derivatives

2．3 提取溶剂的选择

根据香豆素及其衍生物的溶解特性，分别考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等有机溶剂的提取效率。结果表明：采用甲醇作为提取溶剂，虽然大部分香豆素及其衍生物的回收率较高，但二氢香豆素、环香豆素的回收率＜85%；采用甲醇（含0．5%NaOH）作为提取溶剂，10种香豆素及其衍生物，回收率平均值为95．6%。因此，实验选择甲醇（含0．5%NaOH）作为提取溶剂。

2．4 线性关系、检出限和定量限

按上述所建 HPLC法，对质量浓度分别为0．5、1．0、5．0、10．0、25．0、50．0、100．0μg／mL的香豆素及其衍生物混合标准溶液进行测定，以目标物色谱峰峰面积（y）对质量浓度（x，μg／mL）进行线性回归，绘制标准曲线。从表1中可知：香豆素及其衍生物在1．0～100．0μg／mL质量浓度范围内，线性关系良好，相关系数（r2）在0．9997～0．9999之间。

在空白日用香精中添加一系列低浓度的香豆素及其衍生物混合标准溶液，HPLC法重复测定11次，分别以3倍信噪比（S／N＝3）和10倍信噪比（S／N＝10）作为检出限（LODs）和定量限（LOQs）。从表1中可知：10种香豆素及其衍生物LODs为在0．15～0．90mg／kg，LOQs为0．45～3．0mg／kg。

表1 线性方程、相关系数（r2）、检出限和定量限Table 1 Linear equation，correlation coefficient（r2），limits of detection（LODs）and limits of quntification（LOQs）

2．5 回收率和精密度

在空白日用香精中分别添加低、中、高3个浓度水平的香豆素及其衍生物混合标准溶液，进行加标回收率和精密度测定。结果显示：平均加标回收率在90．1%～98．3%范围，相对标准偏差（RSD）为1．1%～4．6%。

2．6 实际样品的测定

随机选取市售15份日用香精实际样品，按上述HPLC法测定样品中香豆素及其衍生物的含量。结果表明：2份样品中检出含有香豆素和4－羟基香豆素，其检出最高含量分别为58．3mg／kg和127．3mg／kg。这表明目前市售日用香精中某些厂家非法添加香豆素或其衍生物，政府行政监管部门应加强对其日常监督监测。

3 结论

本文建立了高效液相色谱法测定日用香精中10种香豆素及其衍生物含量的分析方法，结果表明，该方法操作简单、回收率高、精密度好，适用于日用香精中香豆素及其衍生物的日常检测。