银纳米簇荧光探针对孔雀石绿的测定

李志英，李 洋，郭红霞

（1．忻州师范学院化学系，山西忻州034000；2．华东理工大学化学与分子工程学院，上海021000）

银纳米簇（AgNCs）是一种新型荧光纳米材料，通常在水溶液中以胶体Ag的形态存在［1］，由几个或几十个Ag原子组成，是尺寸介于小分子与纳米颗粒之间的分子级团聚物［2］。由于其直径一般小于2nm，接近于电子的费米波长，会呈现出与半导体类似的特征，产生能级分离并在一定波长光激发下发射荧光［3］。合成的AgNCs在催化、光学、传感、食品安全、生物医学等领域具有良好的应用前景［4］。孔雀石绿（Malachite Green，MG）是一种带有金属光泽绿色的结晶体，化学名称为四甲基代二氨基三苯甲烷［5］。MG是一种合成的工业染料，作为杀虫剂和杀菌剂，广泛用于水产养殖业中。我国从2002年5月将MG列入《食品动物禁用的兽药及化合物清单》［6］中。由于MG的抗菌效果非常好，并且价格低廉，在水产养殖中仍有违规使用的情况发生［7］。

目前检测MG的方法有色谱法、分光光度法、拉曼光谱法以及免疫分析法等［8］。本文以AgNO3为原料合成AgNCs，用微波辐射减少了合成AgNCs的时间，杂质少、纯度高、稳定性较强、操作简便、反应速率快。基于MG可使AgNCs荧光猝灭，建立了检测MG含量的荧光分析新方法，该方法选择性好，可快速检测水产品中的MG。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

RF－5301PC荧光分光光度计（日本，岛津公司）；UV－2550紫外分光光度计（日本，岛津公司）；Tecnai G2F205－TWIN透射电子显微镜（美国，FEI公司）。

AgNO3（国药集团化学试剂有限公司）；2，4－二羟基苯甲醛溶液（上海弘顺生物科技有限公司）；孔雀石绿（MG，沈阳乐衡科技有限公司）；实验所用其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1．2 实验方法

1．2．1 AgNCs的制备 取一个洁净的圆底烧瓶，依次加入2mL 1．0×10－3mol／L聚乙烯亚胺（PEI）溶液，2mL 1．0×10－3mol／L AgNO3溶液，2mL 1．0×10－3mol／L 2，4－二羟基苯甲醛溶液，混合均匀。在功率为260W的微波反应器中加热80s，溶液逐渐由无色变为亮黄色。反应完毕后，冷却至室温，定容到100mL容量瓶中，避光保存在4℃的冰箱中。

1．2．2 AgNCs对MG的检测 取两支洁净的比色管，分别加入1mL的AgNCs溶液，2mL pH＝5的HAc－NaAc缓冲溶液，然后在其中一支比色管中加入5mL 1．0×10－6mol／L的 MG溶液，再用水定容到10mL。室温下反应20min，用1cm比色皿，在激发波长为432nm，发射波长为539nm下测量荧光强度，分别表示为F0、F。其中，F0为AgNCs溶液体系荧光强度；F为AgNCs溶液中加入MG后的荧光强度。计算ΔF（ΔF＝F0－F）。

2 结果与讨论

2．1 AgNCs的表征

图1曲线1说明AgNO3在432nm激发波长下，于507nm左右出现较弱的荧光；曲线2说明AgNCs在539nm左右出现较强荧光，曲线3和曲线4说明二羟基苯甲醛和PEI在432nm激发波长下没有荧光，此现象证明生成了AgNCs，并且发射较强的荧光。用普通微栅支持膜浸渍在AgNCs溶液中，放在红外灯下烘干，重复此操作数次，最后将支持膜放在滤纸上等待测样，用透射电镜扫描得图2。图2表明，合成的AgNCs粒径分布均匀并基本呈球形，其平均粒径为1．7～5nm左右。

图1 AgNCs体系的荧光光谱图Fig．1 Fluorescence spectra of AgNCs system λex＝432nm，λex＝539nm．

图2 AgNCs的透射电镜（TEM）图Fig．2 TEM image of AgNCs

2．2 还原剂和稳定剂的选择

固定其它因素不变，只改变1．0×10－3mol／L PEI溶液和2，4－二羟基苯甲醛溶液的体积分别为0．5、1、2、3、4、5mL，测定还原剂和稳定剂的量对AgNCs荧光强度的影响。结果表明：还原剂用量为1mL，稳定剂用量为2mL时，AgNCs溶液的荧光强度最大。所以本实验选用2，4－二羟基苯甲醛与AgNO3的最佳配比为1∶1，PEI溶液与AgNO3的最佳配比为2∶1。

2．3 微波辐射时间和功率的影响

固定其它条件不变，只改变微波辐射时间依次为60、80、100、120、140s；固定其它条件不变，只改变功率为65、130、195、260、325W，测定反应时间和功率对AgNCs荧光强度的影响。结果表明：当反应时间为80s，反应功率为260W时，生成AgNCs溶液的荧光强度最大。

2．4 AgNCs稳定性实验及荧光量子产率的计算

固定其他条件不变，只改变温度、放置时间、光照、pH、氧化还原剂，测定AgNCs的稳定性。结果表明：温度与放置时间对AgNCs的稳定性几乎无影响，即AgNCs对温度不敏感；放置时间对AgNCs的荧光强度没有影响，光照影响较小。加入配制的体积分数为0．25%的H2O2溶液作为氧化剂，质量浓度为30mg／L的Na2SO3溶液作为还原剂，分别测定AgNCs荧光强度的变化。加入H2O2体系荧光强度变化较小，加入Na2SO3溶液的体系荧光增强，30min后稳定，说明还原剂对AgNCs的荧光强度有影响。

选取硫酸奎宁作为基准物质，已知其在激发波长为432nm处的荧光量子产率为0．577。根据文献方法［9］，计算得 AgNCs的荧光量子产率为0．445。

2．5 AgNCs对MG的选择性

取两支比色管，分别加入1．0×10－3mol／L AgNCs溶液1mL，其中一支加入1．0×10－6mol／L其它物质溶液2mL，用水定容到10mL。在激发波长432nm处，测量荧光强度，分别表示为F0、F，计算ΔF（ΔF＝F0－F），进而求出ΔF／F0的比值，如图3。ΔF／F0值的巨大差异表明了AgNCs对MG具有良好的选择性。

图3 AgNCs对不同物质的响应Fig．3 Response of AgNCs to different compounds

2．6 反应机理

聚乙烯亚胺含有大量氨基，包围在AgNO3周围为模板，用2，4－二羟基苯甲醛在微波辐射条件下还原AgNO3为Ag原子，聚集为水溶性AgNCs，在539nm波长处有绿色荧光，而二羟基苯甲醛与PEI发生交联聚合反应，生成的交联聚合物通过Ph－C＝N作用包围在AgNCs外层，防止AgNCs团聚，并由于保护剂共轭链增加使其荧光增强。MG为三苯甲烷分子，其中的次甲基受三个苯基的影响，有很高的化学活性，能被金属原子置换，MG中间的C与部分Ag原子置换，使AgNCs浓度减小，AgNCs荧光强度也随之降低。据此，可以实现AgNCs对MG的测定。

2．7 pH对体系的影响

用稀HCl和NaOH溶液调节测定体系的pH，研究pH对体系的影响。结果表明ΔF随pH的升高先增大后减小，当反应溶液pH＝5，相对荧光强度ΔF最大，即孔雀石绿对AgNCs的荧光猝灭效果最好。所以本实验选用pH＝5的HAc－NaAc缓冲体系为反应介质。

2．8 反应时间和温度对体系的影响

体系在5min后反应完全，并且在20min时ΔF最大，以后基本不变，实验选择在20min后测定。设定20℃、30℃、40℃、50℃、60℃不同的温度进行反应，结果表明当反应温度为20℃时，ΔF最大，即MG对AgNCs的荧光猝灭效果最好

2．9 工作曲线及检出限

按实验方法分别配制浓度为1．0×10－3、1．0×10－4、1．0×10－5、1．0×10－6、1．0×10－7mol／L的 MG标准溶液，以不加MG溶液作为空白，在激发波长432nm测定荧光强度。实验结果表明：MG在浓度为8．0×10－8～1．2×10－5mol／L成良好的线性关系，其线性关系式为：ΔF＝69．04c＋49．50，相关系数r＝0．9980。做11次空白试验，求得其标准偏差（Sb）为1．17%，利用公式3Sb／K求得检出限为5．0×10－8mol／L。

2．10 干扰离子的测定

对1．0×10－5mol／L MG溶液进行测定，在相对误差≤5%的情况下，共存离子允许的倍数为：1 000倍的K＋、Na＋、NO3－、SO2－4；500倍的蔗糖、蛋白质、氨基酸、PO3－4、CO2－3；100倍的Ca2＋、Mg2＋、Fe3；50倍的 Mn2＋、Cd2＋、Pb2＋、Hg2＋、Zn2＋；20倍的Cu2＋。实验前加入EDTA掩蔽部分金属离子。

2．11 样品的测定 取草鱼、鲤鱼、虾肌肉组织均质，准确称取5．00g于50mL有盖离心管中，加入4mL乙腈，再加入5mL KBH4溶液，涡旋振荡2min，放置10min，期间剧烈振荡2～3次，每次1min。在离心管中继续加入2mL柠檬酸，5mL二氯甲烷，6 000r／min离心5min，收集上层溶液。下层再加入5mL二氯甲烷，剧烈振荡1min，6 000r／min离心5min，合并二氯甲烷层，此步骤重复操作一次。合并后的二氯甲烷层加入10mL水，剧烈振荡1min，6 000r／min离心5min，弃去上层［10］。按1．2．2项下的方法对样品进行测定，结果如表1。

表1 样品的测定结果及回收率（n＝3）Table 1 Determination results of sample and recoveries（n＝3）

3 结论

本实验在水溶液中以2，4－二羟基苯甲醛为还原剂，聚乙烯亚胺为稳定剂，AgNO3为原料，在微波功率为260W的条件下辐射80s，合成直径较小的AgNCs。以AgNCs作为荧光探针对水产品中孔雀石绿进行检测，方法检出限为5．0×10－8mol／L，回收率范围为97%～103%。