痕量氨基酸分析方法研究进展

何继杰，张晓凤＊，钱莉莉，封 丽，赵天涛

（1．重庆理工大学化学化工学院，重庆400050；2．重庆市环境科学技术研究院，重庆400045）

1 前言

氨基酸（Amino Acids，AAs）在环境、食品、生物、医学等领域中都扮演着重要的角色，例如：水源中痕量AAs是形成含氮消毒副产物的重要前体物，其类型和浓度水平对含氮消毒副产物的控制显得尤为重要［1］；食品中痕量AAs常以游离态、多肽和蛋白质等形态存在，是反映食品营养及品质的一个重要指标，也可反映食品是否受污染、添加合成AAs［2－5］；人体尿液或血液中痕量AAs类型与浓度可反映人体各项生理指标［2］。因此，对痕量AAs的快速、准确分析在环境学、营养学、代谢组学和生物学的研究中都十分重要，受到国内外大量研究者的高度重视。

自然界中已发现的AAs有300多种，其中组成生物体蛋白质的约有20种。由于AAs种类繁多，样品基体复杂，且大多不具有紫外或荧光信号，往往无法定量，常需借助衍生化技术将其衍生后再进行测定。目前AAs的分析检测方法主要有：基于通用型仪器的气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳法（CE），以及基于已商品化的氨基酸分析仪法。牟世芬等［6］和邢健等［7］对AAs的分析方法进行了综述，他们比较了不同方法的优缺点，但没有对AAs的类型、数量、检出限，衍生化试剂的性质与适用范围等方面进行综述。基于此，本文对痕量AAs分析的不同方法的关键影响因素进行系统综述。

2 气相色谱法（GC）

采用GC法测定痕量AAs时，需先将AAs衍生为易气化的组分，然后进行分离检测，其关键在于选择合适的衍生化试剂和使用方法的检测限。该方法已用于食品（酸乳酒［8］）、医学（皮肤［9］、尿液［10－11］）、生物（玉米种子［12］、烟草［13］）和环境（发酵液［14］）等领域中痕量 AAs的分析，用到的色谱柱有毛细管柱［9－14］和环糊精手性柱［8］。目前，GC法使用的衍生化试剂主要有氯甲酸乙酯（Ethyl Chloroformate，ECF）、三氟乙酰丙酮（Trifluoro Acetylacetone，FAA）、五氟丙酸酐（Pentafluoro Propionic Anhydride，PFPA）、三氟乙酸酐（Trifluoroacetic Anhydride，TFAA）、N－叔丁基二甲基甲硅烷基－N－甲基三氟乙酰胺（N－Tert－butyl Dimethyl Silyl－N－methyl Trifluoroacetamide，MTBSTFA）和 N－甲基－N－（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（N－methyl－N－（Trimethylsilyl）trifluoroacetamide，MTTFA）。其中，ECF 只能实现对少数 AAs的衍生化［9－12］。为了更有效地衍生多种AAs，Khuhawar等［9］采用ECF＋FAA衍生化体系，实现了皮肤样本中19种AAs的有效衍生化，但衍生化操作较为繁琐。GC法采用火焰离子化检测器的检测限为100～1 000 μg／L［8－9］。而GC与质谱联用其检测限可达到几十至几百ng／L，如对尿液［10］中AAs的检测限可以达到44．8～6 244ng／L。

衍生化产物的稳定性是痕量AAs分析准确性与重现性的关键所在，衍生化试剂的选择性，衍生化条件、衍生化速率、衍生化试剂的价格与危害性是操作能否顺利实施需要重点考虑的指标。文献报道的衍生化方法的具体情况见表1。衍生化试剂FAA、PFPA和TFAA是基于与极性AAs的R基团反应而形成的衍生化产物，MTBSTFA可与含有氨基、羧基、羟基的AAs反应，MSTFA可与含有羟基、羧酸、硫醇和胺类的AAs反应，ECF与AAs反应的机理文献中未见报道。由此可见不同衍生化试剂对AAs衍生化的选择性不同。目前GC法没有一种衍生化试剂能实现20种基本AAs的有效衍生化，其分析测试条件有待进一步探索与优化，才能逐步应用于20种基本AAs及其它各类AAs的分析测定。

表1 GC法衍生化试剂Table 1 Some derivatization reagents for analysis of AAs by GC

3 高效液相色谱法（HPLC）

3．1 HPLC柱前衍生法

HPLC柱前衍生法涉及的衍生化试剂主要有7种，根据衍生化后检测信号不同可分为荧光型衍生化试剂，如邻苯二甲醛（o－Phthalaldehyde，OPA）、丹酰氯（Dansyl Chloride，Dansyl－Cl））；紫外型衍生化试剂如，4－氯－3，5－二硝基三氟甲苯（4－Chloro－3，5－dinitrobenzotrifluoride，CNBF）、异硫氰酸苯酯（Phenyl Isothiocyanate，PITC）、6－氨基喹啉基－N－羟基－琥珀酰亚胺基甲酸酯（6－Aminoquinolinyl－N－hydroxy－succinimide formate，AQC）、Dansyl－Cl和9－氯甲酸芴甲酯（9－Methyl chloroformate，FMOC－Cl）、2，4－二硝基氟苯（2，4－Dinitrofluorobenzene，DNFB））。HPLC柱前衍生法分析的痕量 AAs涉及到食品（枸杞［15］、麦冬［16］、树莓［17］、稻米［18］、荔枝［19］和普洱茶［20］等）、医学（血浆［21］、血清［22］、体液［23］和唾液［24］等）和生物（小鼠脑组织［25］、胚胎干细胞［26］、鱼卵［27］）等领域。HPLC柱前衍生法涉及的色谱柱有 C18柱［15－17，20，．22－25］、生化分析柱［21，27］和氨基酸分析柱［19］。在现有的报道中，采用紫外检测器（UVD）和荧光检测器（FLD）的检测限均可达几百ng／L的水平［15－28］。检测器的选用取决于所采用的衍生化试剂。同GC法一样，衍生化产物稳定性，选择性、操作难易程度和衍生化速率，以及衍生化试剂的价格与危害性等是我们关注的重点。已报道方法的具体情况见表2。

衍生化过程除FMOC－Cl［28］只与AAs上的R基的醇羟基和酚羟基反应外，其余的都能与氨基反应，其中 AQC［26］和Dansyl－Cl［24］还能和R基上的胺反应，而且Dansyl－Cl还能与 AAs的酚羟基反应，故这些衍生化试剂对AAs衍生化选择性也各有差异。综上，除了FMOC－Cl衍生化试剂外，其它衍生化试剂都能实验20种基本AAs的衍生化，但AAs衍生化产物的稳定性、检测器对其灵敏度有待进一步考证。现有报道中，以PITC或OPA为衍生化试剂，在C18柱上，通过UVD或FLD均可以实现20种痕量基本AAs的分析检测，可为我们在建立痕量AAs的分析检测方法提供参考。

3．2 HPLC柱后衍生法

相较于柱前衍生法，柱后衍生需采用特定色谱柱和附设加温装置，价格昂贵，对仪器设备要求较高。衍生化试剂只涉及茚三酮（Ninhydrin，NIN）和OPA两种，具体见表3。HPLC柱后衍生法的样品也涉及了食品（竹笋［29］、黄酒［30］和产贝母［31］）和生物（花粉［32］、百合［33］、烟草［34］）等领域；涉及的色谱柱有：LCA K07／Li柱［30－33］、阳离子树脂填充柱［29］、阳离子交换柱［31－32，34］，其中阳离子交换柱使用较多；阳离子树脂填充柱在120min内实现了竹笋中20种基本AAs的分析测定［35］，LCA K07／Li柱在110min内实现了黄酒中20种基本AAs的分析测定，耗时几乎是GC法和HPLC柱前衍生化法的2倍；检测器以UV和FLD为主，其检测限达μg／L水平，不及HPLC柱前衍生化法。

表2 HPLC柱前衍生法衍生化试剂Table 2 Some precolumn derivatization reagents for analysis of AAs by HPLC

表3 HPLC柱后衍生法衍生化试剂Table 3 Some post－column derivatization reagents for analysis of AAs by HPLC

衍生化过程中，衍生化试剂都是与AAs的氨基反应［33－34］，两种衍生化试剂的选择性相近，但OPA成本更高。根据现有文献，以NIN为衍生化试剂，在阳离子树脂填充柱或LCA K07／Li柱上，利用FLD可实现20种痕量基本AAs的分离检测分析。

4 毛细管电泳法（CE）

为了实现对痕量AAs的CE分离检测，合适的分离体系是其关键。痕量AAs采用CE法涉及的分析样品、缓冲液、分离电压、衍生化试剂、分析时间、方法的检测限等都是需要关注的几个方面。同时由于AAs缺乏生色团，CE法也需要对AAs先进行衍生化处理，再进行分离测定。满足激光诱导荧光检测器（Laser Induced Fluorescence Detector，LIFD）检测分析涉及到几种新的衍生化试剂：4－氯－7－硝基苯并－2－氧杂－1，3－二唑（4－Chloro－7－nitrobenzo－2－oxa－1，3－diazole，NBD－Cl）、4－氟－7－硝基苯并－2－氧杂－1，3－二唑（4－Fluoro－7－nitrobenzo－2－oxa－1，3－diazole，NBD－F）和异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）。CE法涉及到的检测器有：LIFD、UVD、安培检测器（Amperometric Detector，AD）和电容耦合非接触电导检测（Capacitive Coupling non－contact conductivity detection，C4D）。

CE法分析检测痕量 AAs涉及食品（蜂蜜［35］）、医学（药地龙［36］、淮山［37］、太子参［38］和保健饮品［39］）和生物（大脑［40］、尿液／海马组织［41］）等领域；缓冲体系以硼酸盐为主［39－41］，分离电压在－24～22kV 之间［35－43］，这些分离条件是易实现的。但是该方法涉及的AAs种类相对较少，且缺乏对20种基本AAs分离分析的报道。分析时间都在20min内，相对HPLC法和GC法明显缩短［35－43］；由于AD具有高灵敏度，非常适用于痕量AAs的检测，但只局限于具有电化学活性的组分。CE法涉及衍生化试剂相关信息见表4。

CE法分离效果较好，分析速度相对较快，其难以替代的优点在于极低的样品需求量，但CE法重现性较差是限制其广泛应用最大的问题。目前采用CE法进行痕量AAs的检测分析方面的研究较少，有许多待完善和探索的空间。

表4 CE法衍生化试剂Table 4 Some derivatization reagents for analysis of AAs by CE

综上所述，传统痕量AAs衍生化检测分析方法研究相对较多，但操作比较繁琐，影响因素和可能存在的干扰较多，能否适于各类未知样本中20种基本痕量AAs的分析还有待探索，在分析速度和准确性方面还有待提高。如能够实现AAs的直接分离检测，避免衍生化过程受衍生化试剂的选择性、中间产物的干扰、衍生化产物不稳定等多种因素的影响，是实现痕量AAs快速、准确分析的理想途径。

5 直接测定法

传统GC、HPLC和CE法分析测定痕量AAs时，要么受分离技术的限制，如GC只适用于易气化组分，要么受分析检测器的限制，如UV和FLD只适用于对紫外和荧光有响应的组分，AD只适用于具有电活性的组分；痕量AAs检测分析都需要衍生化预处理，而衍生化操作复杂，现有的衍生化试剂适用性范围过窄，当用于未知样品中痕量AAs的快速准确分析时，影响因素过多，重现性往往难以得到保证。目前，痕量AAs的直接检测法主要涉及：利用HPLC法适用范围广的优势与广谱性检测器不受限的特点，HPLC－MS、HPLC－蒸发光散射检测法（Evaporative Light Scattering Detector，ELSD）联用法是比较理想的痕量AAs检测分析方法。HPLC－积分脉冲安培检测技术（Integrated Pulsed Amperometric Detection，IPAD）、高效阴离子交换色谱－积分脉冲安培检测技术（HPAEC－IPAD）也是对电活性组分有响应的痕量AAs检测分析方法。除此之外，还有CE－MS和微流控芯片技术等等。具体见表5。

表5 直接检测法检测痕量AAsTable 5 Direct detection of trace AAs

相对于现行的其他设备，直接检测法极大提高工作效率，减少了因检测周期长而造成检测时样本内个别AAs相互转化的影响，尤其是生物样本，如李鹏飞等［53］采用同位素内标标记LC－MS／MS技术检测AAs，在15min内检测人体内30种AAs。这些新型分析手段的出现将大大促进痕量AAs检测分析技术的发展。

6 氨基酸分析仪法

除了上述基于通用型仪器的GC、HPLC、CE等方法，目前，市场上存在基于商品化的氨基酸分析仪法。该方法是基于HPLC柱后衍生法而发展起来的方法，但无需将待测AAs进行柱前或柱后衍生，且自动化程度比通用型仪器法更高。近来，关于采用AAs分析仪分析检测各领域中的痕量AAs，结果如表6所示。

表6 氨基酸分析仪检测痕量氨基酸Table 6 Amino acid analyzer for the detection of trace amino acids

AAs分析仪法测定痕量AAs的检测限与基于通用型仪器的方法没有显著性差异，这主要是因为它也是根据HPLC柱后衍生法的原理而建立的方法，但其检测的AAs类型相对其他方法的优势较为明显，其能够实现除了20种基本AAs外的AAs的定性和定量，如You Shin等［60］采用AAs分析仪验证16种结构AAs，对婴儿配方奶粉AAs的准确检测起到重要作用，保证了奶粉的合格性。另外，王棘等分别采用HPLC法和AAs分析仪法对肠外营养注射液进行测定，结果发现，相对于HPLC法，AAs分析仪法具有操作简便、分析快速等优点，且线性范围更广，更适合肠外营养注射液中AAs的测定。

将AAs分析仪方法与基于通用型仪器法对比，重点关注适用AAs种类、分析时间、是否衍生化、操作难易、检测限和重现性等指标，结果如表7所示。

表7 AAs检测方法对比Table 7 Comparison of different detection methods for AAs analysis

7 展望

基于通用型仪器法的AAs分析检测技术需要对其进行衍生化处理，操作过程繁琐，影响因素较多：色谱柱类型、衍生化试剂及其适用范围、衍生化操作难易程度、衍生化产物的稳定性、衍生化试剂成本、检测器、检出限等，因此确保方法的重现性是其实现痕量AAs分析检测的关键。综合考虑，痕量AAs的测定时，HPLC柱前衍生法为优先选择考虑的方法；而氨基酸分析仪法显示了其专一性，很好的避免了上述问题，更能够保证数据分析的准确性，但是其本身仪器价格非常昂贵，这也限制了其广泛使用。本文已总结出多种衍生化试剂适用于20种基本AAs及其它各类AAs的定性定量分析，研究者需根据具体情况，选择适当分析测试条件，实现痕量AAs准确快速分析测定。直接分析测定技术避免了繁琐的衍生化步骤，适用于20种基本AAs的快速分析检测，大大简化前处理操作，其中ELSD是HPLC法的一种新型通用性检测器，特别适用于无UV和FLD信号的AAs和糖类组分的测定，但对痕量AAs的分析检测有待结合高效前处理技术（如固相萃取、固相微萃取等），进一步提高该方法的检出限。HPLC－MS的目前痕量AAs分析检测最为理想的选择，但还是受设备成本高的限制。