检测牛奶和水中卡那霉素残留物的电化学适配体传感器研究进展

李凤琴，俞志刚＊，韩贤达，石文兵

（1．长江师范学院化学化工学院无机特种功能材料重庆市重点实验室博士后科研工作站，重庆涪陵408100；2．哈尔滨理工大学化学与环境工程学院，黑龙江哈尔滨150040）

1 概述

卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素，它广泛应用于治疗革兰阳性和革兰阴性菌引起的严重感染，在畜牧业中常作为兽药来使用［1］。与其他抗生素类兽药一样，卡那霉素的普遍应用造成了不同基质，尤其是牛奶和水中存在一定的残留［2－4］。经常饮用和食用含有卡那霉素的饮品和食品，会导致其累积从而对人体产生严重的毒副作用，如失聪、伤肾、药物过敏和耐药性等［5－9］。因此，开发快速而准确的卡那霉素残留检测技术，实现其有效监控，对确保食品和环境安全进而保障人们健康具有重要意义。

近年来，适配体及其筛选技术因显示出特异性高、亲和力强、结合靶标范围宽、易于合成和稳定性好等优点得到了蓬勃发展，在生化分析等领域的应用受到了广泛关注，基于适配体的生物传感技术成为当前农兽药残留新型检测技术的前沿研究热点之一［10－12］。作为一类重要的适配体生物传感技术，电化学适配体传感器具有器件组装成本低、操作简单、免样品前处理、可便携式和易于实现现场监测等特点，是未来发展的重要方向之一［13－14］。

本文对近5年采用电化学适配体传感器方法检测牛奶和水中卡那霉素残留的相关研究进行综述，揭示当前该技术的研究现状、优势、局限性和所存在的问题，并对未来的发展趋势进行展望。

2 电化学适配体传感技术

2．1 适配体简介

适配体（Aptamer）一词最初源于拉丁语“Aptus”，原指为一种可与靶标物质高度契合的聚合物［15］。适配体在本质上是指通过人工合成的可高特异性和高亲和力结合靶标物质的一段单链寡聚核苷酸（DNA和RNA）或肽的片段，其与靶标物质的作用类似于抗原－抗体之间的作用［16］。作为已经被证明是一类传感器应用中重要而有效地分子识别物质，与其他分子识别物质相比，适配体显示出5个方面的突出优点［17］：（1）高的特异性与亲和力；（2）可结合靶标物质范围宽；（3）易于通过化学合成和体外筛选获得；（4）分子量小；（5）稳定性和可重复性好。以上优点使适配体在构建电化学传感器的应用上成为理想的生物接收器［18－20］。

2．2 传感器分类与结构

电化学技术被广泛地用于食品和水中污染物的检测［21－25］。因该技术检测成本低、操作简单快速、抗污染能力强、易微型化和实现在线监测，具有极好的应用化和商业化前景，与其他技术相比，显示出明显的优势。根据输出参数，如阻抗、电流和电位，电化学适配体传感器一般可对应分为三种类型，即阻抗型传感器、电流型（安培／伏安）传感器和电位（电势）型传感器。电化学检测技术与适配体筛选技术相结合，极大地促进了适配体传感器的发展，为解决复杂基质样品中各类污染物分析提供了可行解决方案［26－30］。

电化学适配体传感器主要由敏感分子识别元件和转换器两部分组成。转换器部件一般又分为修饰层、电极基底和电学系统三部分。用作修饰层的物质，如有机分子、导电聚合物和纳米材料等起着适配体和基底的连接作用，可有效改善电子传递效率实现电信号的扩增。用作基底的一般是由不同材料做成的电极，如Au电极、玻碳电极（GCE）、铟锡氧化物电极（ITO）和固体聚合物电极（SPE）等。电学系统通常包括一个信号扩增器、处理器和显示设备，其中检测技术最为重要。敏感分子识别元件又称为生物接收器，其依靠适配体与目标物进行作用，作用大小由转换器测量并输出为可测电信号，该信号与目标物浓度成比例关系，进而显示出目标物在样品中的存在水平，实现定量检测［31－32］。

2．3 电化学检测技术

2．3．1 差分脉冲伏安法（DPV） DPV法被认为是线性扫描伏安法和阶梯扫描伏安法的衍生方法。具体做法是在电势线性扫描和阶梯扫描上施加一系列常规脉冲电压，且在电势改变之前完成电流测定。在DPV法中由于所测电流为电解电流和电容电流之和，且采用电流差值方式对电势作图，可有效减小背景电流中电容电流和杂质氧化还原电流的干扰，因而利于获得高的灵敏度和低的检出限，同时易于在一次扫描中对具有不同氧化还原电势的多种物质实现同时检测，在传感器构建中常被用作定量检测技术，获得了广泛应用。尽管该方法具有明显优点，但在复杂基质中，由几种电活性物质产生的对电流响应的电势干扰仍难以消除［33］。

2．3．2 方波伏安法（SWV） SWV法的本质是一种极谱分析方法。实验方法是在通常的、缓慢改变的直流电压上叠加一个低频率和小振幅的方形波电压，在方波电压方向变化前一瞬间记录通过电解池的交流电流。因该方法在充电电流消失时刻开始记录电流，可有效消除充电电流的干扰，获得高的检测灵敏度。与DPV法一样，SWV法也是传感器构建中最常用的定量检测技术之一［34－35］。

2．3．3 交流伏安法（ACV） ACV法是一种叠加交流电的伏安法。实验方法是在工作电极上施加一个随时间慢扫描的直流电势Edc，并叠加峰－峰值为5mV的正弦波交流成分Eac。测量电流的交流成分的幅值和相对于Eac的相角，得到相应的交流伏安图。图中存在明确的电流峰，其大小与溶液中电活性物质的浓度成正比。由于该方法有效消除了充电电流的干扰，浓度测量精度可达10－7mol／L数量级，适合于定量检测，同时也常用于测量电极反应的动力学参数和研究反应机理［36］。

2．3．4 电化学阻抗谱法（EIS） EIS法是电化学暂态技术的一种。常用的是正弦波交流阻抗技术。实验方法是通过控制电极电流（或电极电势）使其按正弦波规律随时间小幅度变化，同时测量作为其响应的电极电势（或电流）随时间的变化规律。在具体应用中，该方法是通过探测溶液体系中电极／电解液界面性质的特征变化感知电极表面生物分子复合物的形成［37］。通常情况下，该技术比其他电化学暂态技术更易给出电极界面和电极过程动力学的各种参数，同时可以用来对即时发生的两或多个电化学反应进行识别并对如通过钝化膜扩散发生的扩散限制反应进行鉴定。它还可以用来对使用自身电极的组装器件成分进行检测并提供相关的电极转移反应速率信息。近年来，随着阻抗适配体传感器的发展，这一信号输出技术显示出许多显著的优点，如受基质干扰效应小、检测范围宽、稳定性高和易于实现自动化［38］。

3 卡那霉素电化学适配体传感器研究进展

近5年来，随着适配体筛选技术的发展和卡那霉素适配体的报道，采用核酸适配体为分子识别元件的电化学卡那霉素适配体传感器的研究引起了人们广泛关注，具体参数总结对比列于表1，分别为采用DPV、SWV、ACV和EIS四种电化学测量技术对牛奶和水中的卡那霉素残留进行了检测。获得的检测限介于1．3fmol／L～8．6nmol／L之间，普遍低于我国农业部235号公告［57］《动物源性食品中兽药最高残留限量》中规定的抗生素最大残留限定范围1～100ng／g（约为1～100nmol／L），以及欧盟法规标准《欧盟食品中兽药残留限量标准》（EC470／2009）［58］，传感响应时间多数介于30～120min之间。

表1 牛奶和水中卡那霉素检测电化学适配体传感器参数对比一览表Table 1 Data sheet of parameter comparison of reported electrochemical aptasensors for the detection of kanamycin in milk or water

3．1 电流型适配体传感器

3．1．1 基于DPV技术 基于DPV检测技术，研究人员设计了多种精妙方案以大幅度降低对目标物卡那霉素的检测限，进而提高传感器灵敏度，其中最为有效的当属多重循环信号扩增策略的应用。Feng等［48］将杂交链式反应（HCR）和立足点介导链取代反应（TMSTR）结合，实现了对目标物双重信号扩增检测，其检测限值低至16fmol／L。该方法先将S1／S2杂交探针和S3分别自组装在Au电极E－1和E－2表面，其中S1和S2杂交形成S1／S2双链结构。S2中间为适配体碱基序列，两边为立足点序列T1和T2。T1和T2可驱动目标物循环和杂交链式反应。加入卡那霉素后，其与S2反应生成复合物并游离于溶液体系，然后在T1介导下复合物中的S2与S3发生杂交同时将卡那霉素释放进行下一循环，从而实现一级信号扩增。生成的S2／S3双链上暴露的T2可驱动杂交链式反应形成长双链结构因可结合更多的亚甲基蓝（MB）指示剂而实现二级信号扩增。双级信号扩增的实现是该传感器高灵敏度的主要原因。

Wang等［45］将目标物引发多重循环信号扩增的方法引入到传感器的构建中。其方法是：在目标物第一分子卡那霉素的存在下，茎环型探针HP1打开诱发酶辅助目标物循环扩增反应的发生，同时自发引起第二分子卡那霉素的生成。第二分子卡那霉素不仅可以跟HP1杂交且可取代电极上的Helper探针，结果导致标记MB的HP2探针形成封闭型结构，将MB拉近电极表面，电子传递效率大幅度提高，获得了检测限低至1．3fmol／L的超高灵敏度。

近年来，纳米材料如碳纳米管（CNTs）、石墨烯（GR）、导电聚合物（CPs）和金属纳米粒子（MNPs）等，以及其复合材料因具有比表面积高、生物兼容性好、导电效率高和独特的物理化学特性等优点，在改善电极表面电子传递效率方面表现优异，越来越多地被应用于适配体传感器的制备中［59－64］。Guo［43］以MWCNTs、1－丁基－3－甲基六氟磷酸盐咪唑鎓离子液体和纳米孔PtTi（NP－PtTi）合金复合材料修饰GCE，构建了基于适配体的卡那霉素传感器。以DPV法为定量信号测量技术，在优化条件下，对卡那霉素检测的线性范围为0．05～100ng／mL，获得的检测限为3．7pg／mL。Xu等［41］则采用了石墨烯－聚苯胺（GR－PANI）和聚酰胺－胺型树枝状高分子功能化的AuNPs（PAMAM－Au）复合材料，同时借助HRP对H2O2的酶催化反应，获得了对卡那霉素4．6pg／mL的检测限。该传感器在构建上先分别用GR－PANI和PAMAM－Au滴涂在GCE表面，再依靠静电吸附作用将卡那霉素抗体固定，最后用牛血清白蛋白（BSA）和10个碱基的A序列即Poly（A）10混合溶液封闭电极。在信号机制上采用了夹心型结构形成结合酶催化的信号转换方式：在卡那霉素存在时，抗体与卡那霉素结合，HRP标记的链霉亲和素和修饰适配体的生物素结合，并通过适配体与卡那霉素作用以三明治结构耦合在电极表面，在H2O2体系中借助HRP的催化作用产生高的催化电流；相反，在无卡那霉素的情况下，耦合作用无法发生，催化电流低。作为高效的电流信号扩增反应方式，酶催化引入传感信号机制利于获得高的灵敏度，但同时也存在对实现条件要求苛刻而产生的检测不稳定缺陷，不利于在实际复杂样品体系中的应用。

3．1．2 基于SWV技术 基于SWV检测技术，Xu等［52］在传感器构建中引入核酸外切酶，并借助其循环剪切作用实现了对卡那霉素低至1pmol／L检测限的超灵敏检测。该传感器信号机制为：加入卡那霉素之前，适配体互补DNA（cDNA）的巯基化5′端通过Au－S键嫁接于电极表面，并与适配体以完全互补杂交双链存在。加入核酸外切酶，因其剪切作用引发cDNA的自消化并释放适配体，被释放的适配体开始第二轮剪切过程，并循环进行至电极表面所有cDNA自消化完毕。此时残余cDNA很短，钌离子吸附量少，电子传递效率低，获得背景电流小；加入卡那霉素后，因其与适配体结合形成适配体／卡那霉素复合物从而抑制了适配体与cDNA的杂交，核酸外切酶不起作用，电极表面cDNA长度不变，钌离子吸附量变大，电子传递效率增高，检测电流增强。该传感体系因借助核酸外切酶的循环剪切作用实现了背景信号的大幅度压缩，利于相对增大响应信号变化绝对值而获得较高的传感灵敏度。Chen等［53］建立了同时检测卡那霉素和四环素的分析方法。该传感器在构建上先将分别负载Cd2＋和Pb2＋的金属有机框架材料（MOFs）分别与卡那霉素适配体和四环素适配体结合，形成两目标物的示踪信号探针（分开的出峰电流示踪各自的电流信号），然后利用anti－ssDNA抗体与适配体DNA之间的特异性作用将两示踪信号探针混合嫁接于免疫磁珠表面从而构筑成混合型适配体传感器；在信号机制上借助RecJf核酸外切酶催化目标物的循环扩增方法：在加入卡那霉素和四环素之前，因磁珠表面布满示踪信号探针背景电流信号高；加入两目标物后，因适配体与各自目标物反应导致示踪信号探针与磁珠分离，同时RecJf核酸外切酶将适配体剪切释放目标物实现第一次循环，释放出的目标物可激发下一循环的发生，循环往复以实现对磁珠表面示踪信号探针的无限次循环剪切，从而获得超低的检测电流。利用该方法传感器对两种目标物获得了较低的检测限，对卡那霉素为0．15pmol／L，对四环素为0．18pmol／L。同时，该课题组在该工作基础上又借助核酸内、外切酶作用实现了双循环信号的扩增，并用于卡那霉素和氯霉素的同时检测，获得了较高的灵敏度，对两目标物的检测限分别为35fmol／L和21fmol／L［54］。

3．1．3 基于ACV技术 基于ACV检测技术，本课题组［55］建立了基于信号探针转移机制的传感器用于牛奶、水和血清中卡那霉素残留物检测。如图1所示，在信号机制上采用了目标物诱导信号探针转移的方式：加入卡那霉素之前，捕获探针与辅助探针以双链的“单撑式”结构存在，因信号探针游离于溶液体系中，标记指示剂亚甲基蓝（MB）远离电极表面，电子传递效率低，背景电流小；而加入卡那霉素后，卡那霉素被捕获探针捕获，取代辅助探针与捕获探针反应形成捕获探针／卡那霉素茎结状复合物，释放后的辅助探针与游离于溶液中的信号探针杂交成双链结构将MB拉近至电极表面，电子传递效率增大，检测电流升高。该体系因信号探针的游离而获得了超低的背景信号，利于获得高的灵敏度，对卡那霉素的检测限低至3．3 pmol／L，同时获得了较快的传感速度。

3．2 阻抗型适配体传感器

图1 基于目标物诱导信号探针转移机制的适配体传感器工作示意图［55］Fig．1 Working schematic diagram of aptamer sensor based on target－induced signaling probe shifting mechanism［55］

基于EIS检测技术，Sharma研究组［56］构建了一次性便携式的阻抗适配体传感器用于牛奶中卡那霉素的检测。在信号机制上采用了阻抗增强的方式：加入目标物之前，电子传递效率高，阻抗小；加入目标物后，适配体特异性捕获目标物形成复合物覆盖在电极表面，阻碍了电子传递通道，阻抗增大。阻抗变化与目标物浓度相关。在优化条件下，该传感器对目标物检测获得了1．2～75ng／mL的线性范围和0．11ng／mL的检测限。以链霉素（Streptomycin）和庆大霉素（gentamicin）为参照干扰物，显示出对卡那霉素较好的选择性，同时以牛奶为实际样品对该方法进行加标回收率考察，获得回收率为96．88%～100．5%（RSD＝4．56%，n＝3）的较好结果。

4 结语

对已有适配体卡那霉素研究成果综述分析表明，随着适配体筛选技术和电化学、光学等多种检测技术，以及各种纳米及其复合材料的发展与联合，精妙的传感设计不断涌现，基于卡那霉素适配体的传感器获得了较好的发展，但仍然停留在理论和实验室研究阶段，距离实际应用化的路还很长，关键问题仍有待解决和完善，主要体现在如下三方面：（1）提高灵敏度：文献所报道传感器的检测限尽管大部分都很低，可满足实际样品检测限的要求，但都是在纯缓冲溶液体系中得到，受基质干扰影响，在实际复杂样品中会有明显降低。这些传感器的灵敏度仍有待提高；大部分文献之所以获得了较高灵敏度，均借助了酶促反应实现信号扩增或采用纳米材料进行电极修饰以提高电子传递效率，由于操作条件苛刻和不稳定，在实际复杂基质样品中不易获得良好的表现，难以应用化。因此，开发无酶无纳米材料修饰的高灵敏度传感器是实现应用化的客观要求；（2）改善特异性：传感器对靶分子的特异性在很大程度上由所用适配体对靶分子的特异性所决定。受筛选时的实验误差和所构建传感器的传感环境与适配体筛选时实际化学环境的差异以及报道结果的主观因素等多方面影响，传感器的特异性表现往往并不完美。通过优化所构建传感器的结构进一步改良特异性是期待解决的问题；（3）提高传感速度：已报道的传感器响应速度慢，普遍介于30～120min，考虑到实际应用时其他必要步骤的消耗，完整检测过程耗时长，不利于建立现场快速监测方法，有待改进。

有理由相信，通过科研工作者的不懈努力，制约传感器发展的瓶颈问题必定会逐步解决，设计和构建具有实际商业化价值的快速、准确和便携式电化学适配体传感器设备实现兽药残留的在线监测是一个具有广阔应用前景的目标，值得研究和期待。