固相萃取－超高效液相色谱－串联质谱法测定地表水中10种磺胺类抗生素残留

庞昕瑞，曾鸿鹄，2，3，梁延鹏＊，2，3，覃礼堂，2，3，莫凌云，2，3

（1．桂林理工大学环境科学与工程学院，广西桂林541004；2．广西环境污染控制理论与技术重点实验室，广西桂林541004；3．岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心，广西桂林541004）

随着养殖业的迅速发展，我国兽药抗生素的使用量在日益增加［1］。由于磺胺类药物（Sulfanilamide，SAs）是最早人工合成的抗生素之一，其具有抗菌谱广、性质稳定、价格低廉等优点，被广泛用于人工养殖和临床治疗，成为使用量最大的抗生素之一［2］。但是，SAs难以被动物吸收代谢且迁移性强、难降解［3］，因此约60%～90%的原药［4］和代谢产物随粪便和尿液排出动物体外后，通过淋溶、渗透等方式进入自然环境中，对地表水、土壤和地下水造成污染［5－6］。因此，对我国自然环境中磺胺类药物的污染水平进行分析研究是十分必要的。

自然环境中抗生素的浓度大多处于ng／L～μg／L水平，且环境基质复杂多样，因此需要根据实际的环境条件对前处理和分析方法进行优化选择。环境样品中SAs抗生素的检测通常是先经过固相萃取（SPE）富集净化，再结合高效液相色谱－紫外／荧光检测器（HPLC－UVD／FLD）［7］、高效液相色谱－质谱（HPLC－MS）［8］、高效液相色谱－串联质谱（HPLC－MS／MS）［9］、超高效液相色谱－串联质谱（UPLC－MS／MS）［10］等方法进行检测。由于超高效液相色谱在灵敏度、分离度、分析效率上较高效液相色谱有很大的提高，可大大缩短分析用时、降低实验溶剂用量。因此，本研究采用SPE－UPLC／MS／MS建立了同时检测地表水水样中10种SAs抗生素残留的分析方法。该方法操作简单、灵敏度高、重现性好、实用性强，可快速地完成对目标物的分析，为水体中SAs药物的定性定量分析检测提供技术保障，并已成功应用于湿地地表水中10种SAs抗生素残留的检测。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

WatersXevo TQ－S Micro超高效液相色谱－三重四极杆质谱仪（美国，Waters公司）；AQUA Trace ASPE 799型固相萃取仪（日本，岛津公司）；双频超声波清洗器；24位氮吹仪；Vortex Genie 2涡旋振荡器。

10种磺胺类药物标准品：磺胺嘧啶（SD）、磺胺吡啶（SPY）、磺胺甲基嘧啶（SMR）、甲氧苄啶（TMP）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲氧哒嗪（SMP）、磺胺氯哒嗪（SCP）、磺胺甲恶唑（SMZ）、磺胺地索辛（SDM）、磺胺喹噁啉（SQ），纯度≥97%，均购自 Dr．Ehrenstorfer GmbH 公司（德国）；甲醇（色谱纯，＞99．9%，德国 Merck公司）；甲酸（色谱纯，≥98．0%，阿拉丁）；乙酸乙酯（色谱纯，＞99．0%，阿拉丁）；其他试剂均为国产分析纯试剂，水为Milli－Q型超纯水仪（美国，Millipore公司）制备的超纯水。

1．2 混合标准储备溶液与工作溶液的配制

精确称量各标准品10mg，分别置于100mL棕色容量瓶中，加入甲醇超声溶解后定容，配成质量浓度为0．1g／L的单标准储备溶液，于－20℃下储存。取上述储备溶液用甲醇稀释为500μg／L的混合标准工作溶液，现用现配。

1．3 样品前处理

1．3．1 水样采集和预处理 采集1L桂林会仙湿地部分地表水水样于棕色玻璃瓶中，用稀H2SO4先将水样pH调至4．0～6．0，于4℃保存。水样运回实验室后立即经0．45μm玻璃纤维滤膜过滤，用稀H2SO4和氨水调节水样pH＝6．0，并在3d内完成对所有水样的固相萃取。

1．3．2 样品的固相萃取 依次用5mL的乙酸乙酯－甲醇（1∶1，V／V），5mL 氨水－甲醇（3∶100，V／V）溶液，5mL超纯水活化Oasis HLB固相萃取柱（6mL／500mg，美国 Waters公司），取500mL水样以3mL／min流速过柱，用6mL超纯水淋洗萃取柱，在氮气下干燥20min，再依次用5．5mL乙酸乙酯－甲醇（1∶1，V／V），5．5mL氨水－甲醇（3∶100，V／V）溶液进行洗脱，最后将收集的洗脱液在氮气下缓慢地吹至近干，加入1mL含30%甲醇溶液超声溶解残留物，漩涡混合约1min，过0．22μm滤膜后，置于棕色进样瓶中，待上机测定。

1．4 测定方法

1．4．1 色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱（100×2．1mm，1．7μm）；流动相为含0．1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脱条件：0～1min，10%～12%B；1～7min，12%～50%B；7～10min，50%～70%B；10～10．1min，70%～10%B；10．1～12min，10%B。柱温为40℃；进样量为2μL；流速为0．3mL／min。

1．4．2 质谱条件 电喷雾电离（ESI）；正离子扫描（ESI＋）模式；毛细管电压：2．94kV；脱溶剂温度：600℃；离子源温度：150℃；脱溶剂气流速：1 000L／h；监测方式为多时段－多反应（MRM）监测。10种目标物的质谱检测参数见表1。

表1 目标抗生素的MRM MS参数Table 1 Parameters of MRM MS for target antibiotics

2 结果与讨论

2．1 质谱－色谱条件的优化

首先对仪器进行自动调谐，参考调谐文件对质谱参数进行优化。实验发现没有锥孔气流速时，目标物的峰形不发生分叉且响应值高。为提高离子扫描时目标物的灵敏度，本研究考察了不同比例甲酸水溶液作流动相对目标物灵敏度的影响。结果表明在含0．1%甲酸水溶液条件下各物质的峰形、响应值和分离度达到最佳状态。此外，有研究表明，色谱柱的长短会影响目标物的分离效果和保留时间［11］。本实验研究了色谱柱柱长对目标物的色谱行为的影响，结果显示当色谱柱柱长为50mm时，目标物无法达到理想的分离效果和出峰情况；当色谱柱柱长为100mm时，10种目标物的峰形无拖尾：TMP和SM2可完全分离、SMP和SCP质谱检测可分离、SQ和SDM的峰形更加尖锐且无分叉，如图1所示。因此实验选用柱长为100mm的色谱柱进行色谱分离。

图1 10种磺胺类抗生素的总离子流（TIC）色谱图（色谱柱长100mm）Fig．1 TIC chromatogram of 10sulfonamide antibiotics with column length of 100mm1．SD；2．SPY；3．SMR；4．TMP；5．SM2；6．SMP；7．SCP；8．SMZ；9．SDM；10．SQ．

2．2 固相萃取条件的优化

2．2．1 洗脱溶剂、洗脱体积、萃取柱的选择 乙酸乙酯常用做萃取剂、提取剂，且极性小于甲醇。实验结果显示单独用甲醇进行洗脱回收率低于乙酸乙酯－甲醇（1∶1，V／V）。有研究［12］表明，在甲醇中加入氨水可以改变目标物在固相萃取柱上的存在形态，降低固相萃取柱对目标物的相互作用力，增大回收率，因此本实验优化了萃取体系中氨水比例，发现在体系中加入3%的氨水更容易将目标物洗脱下来（图2）。为确保洗脱完全，进行两次洗脱，结果表明第二次洗脱目标物残留均小于0．05μg／L。最终确定依次用5．5mL乙酸乙酯－甲醇（1∶1，V／V），5．5mL 氨水－甲醇（3∶100，V／V）淋洗固相萃取柱。此外，本研究分别考察了C18固相萃取柱（6mL／500mg，德国CNW 公司）、Oasis HLB固相萃取柱（6mL／500mg，美国 Waters公司）对目标物的富集效果。结果显示，HLB柱的回收率明显优于C18柱。

2．2．2 水样pH值和水样上样流速的选择 水样的pH很大程度地影响了目标物在水样中的存在形态、稳定性以及固相萃取柱对目标物的富集效果，因此用稀H2SO4和氨水将水样（超纯水）pH值分别调节为2．0～7．0进行回收率对比实验。由图3可知，当pH＜6．0时，SCP、SMZ、SDM和SQ的回收率均未达到80%；而当pH＝6．0时，各目标物的回收率均有明显提高，上述4种物质的回收率提升至85．15%～89．79%；pH＞6．0时，各目标物的回收率较在pH＝6．0的条件下略有下降，因此本研究选择将水样调至pH＝6．0。

图2 洗脱液中氨水比例对10种抗生素回收率的影响Fig．2 Effect of ammonia ratio in eluents on recoveries of the ten antibiotics

图3 水样pH对10种抗生素回收率的影响Fig．3 Effect of pH on the recoveries of the ten antibiotics in water samples

考察了不同上样流速（3、5、10mL／min）对目标物回收率的影响。研究表明，当上样流速为10mL／min时，仅TMP的回收率为88%，其他物质的回收率为69．8%～75．63%；当上样流速为5mL／min时，对SD的富集效果仍不理想，回收率为73．62%；当上样流速为3mL／min时，除SCP的回收率为74．61%外，其余9种目标物的回收率保持在80．85%～89．01%。此外，当上样流速从3mL／min升至10mL／min时，对SD和SPY回收率的损失达11%。因此最佳上样流速选为3mL／min。

2．3 基质效应

用质谱定量分析环境样品时，基体效应（离子抑制或者离子增强）会影响目标物定量结果的准确度，因此在实验时需要考虑基质效应的影响。按照文献报道［13］研究基质效应的方法进行实验。结果表明，10种目标物的基质效应在81．17%～103．76%之间。当基质效应在80%～120%范围内，可忽略基质效应［13］。

2．4 方法的线性范围及仪器的检出限和定量限

配制10种目标物的混合标准溶液系列（1～500μg／L），按上述色谱－质谱条件进行分析，采用外标法和离子比（定量离子／定性离子）定量，结合目标物出峰的保留时间、母离子和子离子（定性离子和定量离子）进行定性。分别用3倍和10倍信噪比对应的标样浓度来估算仪器的检出限、定量限。结果表明10种目标物在1～500μg／L范围内线性关系良好，相关系数r2＞0．999，结果见表2。

表2 10种抗生素的保留时间、线性方程、相关系数（r2）、检出限和定量限Table 2 Retention time，linear equation，correlation coefficient（r2），limits of detection（LODs）and limits of quantification（LOQs）of the ten antibiotics

2．5 加标回收率及方法检出限

准确量取500mL桂林会仙湿地地表水，分别以低（10ng／L）、中（50ng／L）、高（100ng／L）3个浓度水平对水样进行加标，做6个平行样，同时作空白对照。按1．3及1．4节所述方法对水样进行处理和分析。由表3可知，10种目标物的低、中、高浓度加标回收率分别为81．90%～93．69%、77．94%～96．83%、84．14%～104．98%，相对标准偏差（RSD）＜8．1%，方法检出限在0．12～0．84ng／L范围内，且水样进行低浓度加标实验时各物质的峰形尖锐完整，基线平稳（图4）。说明该方法灵敏度高、重现性好、检出限低、结果准确可靠。

表3 10种抗生素的水样加标回收实验、相对标准偏差和方法检出限（LODs）（n＝6）Table 3 Spiked recoveries，relative standard deviations（RSDs），and limits of detection（LODs）for ten antibiotics in water samples（n＝6）

图4 水样加标质量浓度为10ng／L时目标物的MRM色谱图Fig．4 MRM chromatograms of the target analytes in water samples spiked at 10ng／L

2．6 实际样品测定

按照本文所建立的方法对4个桂林会仙湿地地表水水样（S1、S2、S3、S4）进行处理和分析。其中SMR、SM2、SMP、SCP在4个采样点的检出率为100%，含量为0．14～1．71ng／L，TMP仅在S4处检测出，含量为1．44ng／L。由于采样点S1、S2靠近村庄，SMZ为人体抗菌常用药，所以含量偏高，分别为8．84ng／L、25．80ng／L。

3 结论

通过SPE－UPLC－MS／MS法分别对环境水体中10种磺胺类抗生素进行净化富集和分析检测。在优化的实验条件下，10种目标物在1～500μg／L范围具有良好的线性关系，相关系数r2在0．9995～0．9999范围内，仪器检出限和定量限范围分别为0．01～0．05μg／L和0．05～0．17μg／L，平均水样加标回收率为77．94%～104．98%，RSD为2．18%～8．09%，方法检出限＜0．84ng／L。该方法回收率较高、精密度高、重现性好、基质干扰低、操作简单、使用试剂环境友好，适用于实际环境地表水中磺胺类抗生素检测。