氮硫掺杂荧光碳点测定菇类食品中维生素B2的研究

李 宏，赵纯希，王翰墨，侯朝祥，周继伟，杨亚玲＊

（1．云南省农业科学院农产品加工研究所，云南昆明650200；2．昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500）

维生素B2（VB2）又名核黄素，属于水溶性维生素，在中性和酸性溶液中加热能稳定存在。维生素B2是人体所必需的维生素，是体内黄酶类辅基的组成部分，参与体内许多酶系统的重要辅基的组成，与机体内各种物质和能量代谢密切相关［1］。当体内维生素B2缺乏时就会引发为口、眼等部位的炎症，表现为口角炎、舌炎、唇炎、眼结膜炎等［2－3］。体内维生素B2的储存是很有限的，因此机体都要从食物中摄入。适量的维生素B2摄入能够保证机体各种代谢的正常。目前测定维生素B2的方法有多种，例如高效液相色谱法［4－6］、毛细管电泳法［7］、荧光法［8］、电化学法［9－11］等。但是这些方法存在有的时间冗长，有的过程繁杂等不足。

相对于传统的半导体量子点，碳点（Carbon Dots，CDs）具有低毒性、环境友好等优点而受到研究者们的关注。CDs是一种新型的具有荧光特性的纳米碳材料，尺寸较小，一般在10nm以下［12］。由于CDs具有半导体量子点所没有的优点，所以其有广泛的应用前景，包括传感［13－17］、细胞成像［18－20］和药物传递［21］。除了一般含有C、N、O元素的CDs外，掺杂CDs也越来越被人们所关注，例如掺杂N、S、B、P等元素的CDs［22－25］。许多研究表明掺杂CDs具有更高的荧光量子产率［26－27］。近年来，有研究将荧光共振能量转移（FRET）的原理应用于维生素B2的测定。钟文英等［28］用以谷胱甘肽为稳定剂合成的ZnSe量子点（供体）与维生素B2（受体）组成FRET体系，确定两者之间发生FRET的最佳条件，建立了FRET的荧光猝灭法测定维生素B2的含量。基于FRET测定维生素B2的含量为维生素B2的测定提供了新思路。

本研究用尿素和半胱氨酸通过水热法合成了同时掺杂N、S元素的碳点（N，S－CDs），所合成的N，SCDs具有良好的荧光性质、水溶性以及较高的荧光量子产率。合成的N，S－CDs用透射电镜（TEM）、傅里叶变换红外（FT－IR）光谱、X射线光电子能谱（XPS）等进行表征，并将其与维生素B2组成FRET体系用于维生素B2的含量检测。结果表明，维生素B2的浓度在1．0×10－7～1．5×10－5mol／L范围内与 N，S－CDs荧光猝灭程度呈良好线性，相关系数为0．9911，检出限为5．0×10－8mol／L。此方法用于实际样品检测，加标回收率为97．2%～104．3%，为维生素B2的分析研究提供了一种新方法。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

Tecnai G2型透射电子显微镜（美国，FEI公司）；EDX－3600B型能谱（XPS）分析仪（江苏天瑞公司）；UV－2500型紫外－可见分光光度计（日本，岛津公司）；G9800A型荧光分光光度计（美国，安捷伦公司）；TENSOR27型傅里叶变换红外光谱仪（德国，布鲁克公司）。

尿素、半胱氨酸、维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素C、谷胱甘肽、葡萄糖、果糖、麦芽糖均购自阿拉丁试剂有限公司；草酸、NaCl、KCl、ZnSO4、CaCl2、CuSO4、MnCl2、FeCl3均购自天津化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯，使用前未经任何处理。实验用水为超纯水。

实验中所用的香菇、冬菇、元菇和杏鲍菇均购买于当地超市。

1．2 实验方法

1．2．1 N，S－CDs的合成 分别称取尿素和半胱氨酸各0．5g，溶于100mL超纯水中，然后将溶液转移到聚四氟乙烯内衬的反应釜中，置于马弗炉中，在180℃下反应6h。反应结束后，自然冷却至室温。然后将溶液在10 000r／min下离心20min，用0．22μm的滤膜抽滤并将滤液透析24h。所得溶液即为纯化的N，S－CDs，在4℃下保存备用。

1．2．2 样品的前处理 实验中选择菇类为检测对象。将晒干的菇类粉碎，然后称取2g粉末于烧杯中，加入20mL 0．1mol／L HCl，称重。加热煮沸30min，自然冷却至室温后，称重并补足重量。然后滴加3mL 2．5mol／L NaAc，过滤，将滤液定容到25mL的容量瓶中，待用。

1．2．3 维生素B2的检测 取5μL N，S－CDs溶液于10mL的离心管中，用超纯水稀释到3mL，然后将不同浓度的维生素B2标准溶液或经过处理的样品加入其中，并在激发波长为350nm、发射波长为440nm下测定荧光强度。

CDs的合成及其检测维生素B2的机理图如图1所示。

图1 N，S－CDs的合成及其检测维生素B2示意图Fig．1 Schematic illustration of the synthesis of N，S co－doped CDs and application for the detection of vitamin B2

2 结果与讨论

2．1 N，S－CDs的表征以及性质研究

图2A为N，S－CDs的TEM图，从图中可以看出合成的N，S－CDs呈球形，且粒径均匀，分散性较好，粒径分布如图2A中插图所示，大约为2．8±0．4nm。

图2B为N，S－CDs的FT－IR光谱图，图中3 400cm－1处左右的宽峰对应O－H、N－H的伸缩振动；在2 943、2 306、1 601cm－1处的峰对应C－H、S－H 和 C＝O的伸缩振动；在1 406、1 118、1 039cm－1处的峰对应C－N、C－S和C－O的伸缩振动。

图2C为 N，S－CDs的 XPS的全谱图，在531．9、400．5、284．3、164．3eV 处有四个峰，分别对应于O 1s、N 1s、C 1s和S 2p。C 1s能谱图中在284．3、285．1、285．4、286．0、286．5、288．3eV 处的峰分别为C－C、C－H、C－S、C－N、C－O和C＝O的特征峰。N 1s能谱图中在399．2、401．1eV处的两个峰为C－N和N－H的特征峰。O 1s能谱图中在531．6、532．2eV处的两个峰为C＝O和C－O的特征峰。S 2p能谱图中在163．5、164．8eV处的两个峰为S 2p3／2和S 2p1／2的特征峰。XPS的分析结果基本与FTIR的一致。因此，所合成的N，S－CDs含有羧基、氨基、羟基、巯基等官能团，具有良好的水溶性。

图2 （A）N，S－CDs的透射电镜（TEM）图；（B）N，S－CDs的FT－IR光谱图；（C）N，S－CDs的XPS谱图Fig．2 （A）TEM image of N，S－CDs；（B）FT－IR spectrum of N，S－CDs；（C）XPS spectrum of N，S－CDs

图3 （A）为N，S－CDs的紫外－可见吸收光谱和荧光光谱。从图中可以看出其在236nm和336nm处有两个吸收峰，最大发射波长为350nm，最大激发波长为440nm。图（3）B为N，S－CDs在不同激发波长下的发射光谱图，当激发波长逐渐增大时发射波长无明显变化，并在激发波长为350nm处荧光强度最强。以硫酸奎宁（54%，0．1mol／L H2SO4）为参考物质，测得该N，S－CDs的荧光量子产率大约为21%。

图3 （A）N，S－CDs的紫外－可见吸收光谱和荧光光谱；（B）不同激发波长下的发射光谱图Fig．3 （A）The UV－Vis absorption spectra and fluorescence speatra of the N，S－CDs；（B）Fluorescence emission spectra of N，S－CDs at different excitation wavelengths from 320to 380nm

2．2 N，S－CDs的荧光猝灭机理

N，S－CDs的荧光发生猝灭，主要机理为N，S－CDs和维生素B2之间发生了FRET。由图4（A）可知，N，S－CDs最大发射波长为440nm，维生素B2的激发光谱在372nm和446nm处有两个峰，对应的发射波长为525nm，作为供体的N，S－CDs的发射光谱与受体维生素B2的激发光谱有非常好的重叠，这将有利于FRET的发生。另外，从图4（B）可知，随着维生素B2的加入，N，S－CDs的荧光发生猝灭，而维生素B2的荧光峰增强，所以N，S－CDs和维生素B2之间发生了FRET。

图4 （A）维生素B2的激发光谱（1）、发射光谱（2）和N，S－CDs的发射光谱（3）；（B）N，S－CDs不加维生素B2（1）、加低浓度维生素B2（2）和高浓度维生素B2（3）后的荧光光谱图Fig．4 （A）Excitation（1），emission spectrum（2）of vitamin B2and emission spectrum of N，S－CDs（3）；（B）Fluorescence spectrum of N，S－CDs without vitamin B2（1），with low（2）and high（3）concentration of vitamin B2

2．3 反应条件优化

实验中考察了pH和孵育时间对N，S－CDs测定维生素B2的影响。如图5（A）所示，在pH为3～7时，N，S－CDs的荧光随着pH的增加而增强，在pH大于7之后，N，S－CDs的荧光强度基本不变。而加入维生素B2后，pH对体系的荧光也有影响，由图中可以看出，在pH为7时，N，S－CDs的荧光猝灭程度达到最大。综上所述，选择体系为pH＝7。图5（B）所示为加入维生素B2后，N，S－CDs的荧光发生猝灭，并且5min后体系的影响强度几乎保持不变，所以反应时间选为5min。

图5 （A）pH对N，S－CDs（1）和反应体系荧光强度（2）的影响；（B）反应时间对体系荧光强度的影响Fig．5 （A）The effect of pH on fluorescence intensity of N，S－CDs（1）and reaction system（2）；（B）The effect of reaction time on the fluorescence intensity

2．4 N，S－CDs荧光猝灭测定维生素B2

图6 （A）体现了不同浓度的维生素B2对N，S－CDs的荧光强度的影响。从图中可知随着维生素B2的浓度逐渐增加，N，S－CDs的荧光逐渐被猝灭。图6（B）表明维生素B2浓度在0．1～15μmol／L的范围内时，与N，S－CDs的荧光猝灭程度呈线性关系，线性方程为：F／F0＝－0．0339c＋0．9006，相关系数为0．9911。其中F和F0分别为加入不同浓度维生素B2前后N，S－CDs的荧光强度，c为维生素B2的浓度。

图6 （A）维生素B2浓度对N，S－CDs荧光强度的影响（插图：加入不同浓度维生素B2后体系的光谱图）；（B）F／F0和不同浓度维生素B2之间的线性关系Fig．6 （A）The effect of different concentration of vitamin B2on the fluorescence intensity of N，S－CDs（Inset：fluorescence spectra of system after the addition of different concentration of vitamin B2）；（B）The linear relationship between F／F0and different concentrations of vitamin B2

2．5 N，S－CDs荧光猝灭测定维生素B2的可行性

考察了N，S－CDs测定维生素B2的可行性。在相同实验条件下，相同浓度的维生素A、维生素B1、维生素C、葡萄糖、果糖、麦芽糖、草酸、谷胱甘肽、Na＋、K＋、Zn2＋、Ca2＋、Cu2＋、Mn2＋、Fe3＋对维生素B2的检测无明显干扰，因此所制备的N，S－CDs对维生素B2有较好的选择性，不易受其它可能共存物质的干扰。

2．6 实际样品检测

检测了实际样品菇类食品中维生素B2的含量。将样品按前述方法处理好后用于检测，每个样品平行测定5次。表1为各种菇中维生素B2含量及回收率测定结果，其中1＃、2＃、3＃和4＃分别为香菇，冬菇，元菇和杏鲍菇。结果表明加标回收率为97．2%～104．3%之间，相对标准偏差（RSD）低于5．6%。同时采用高效液相色谱法（HPLC）进行测定，结果表明两种方法没有明显差异。因此，此方法可用于菇类食品中维生素B2的测定。

表1 几种菇中维生素B2的含量测定（n＝5）Table 1 Determination of vitamin B2in mushrooms（n＝5）

3 结论

本实验中用尿素和半胱氨酸合成N、S共掺杂的N，S－CDs，该N，S－CDs具有良好的荧光特性。将其与维生素B2构成荧光共振能量转移体系，用于维生素B2的测定，建立一种检测维生素B2的方法，具有良好的应用前景。