加速溶剂萃取／液相色谱－串联质谱法测定鹌鹑蛋和鸽蛋中氯霉素类药物残留

王 波，赵 霞，谢恺舟＊，王雅娟，郭亚文，卜晓娜，刘楚君，张跟喜，张 涛，刘学忠

（1．扬州大学兽医学院，江苏扬州225009；2．教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏扬州225009；3．扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009）

氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）、氟苯尼考（FF）同属于氯霉素类药物（CAPs），他们的抗菌机理相似，对革兰氏阳性菌和阴性菌都有作用，但对阴性菌的作用强于阳性菌，并广泛用于畜禽生产中。由于CAPs在动物源性食品中残留会造成人的再生障碍性贫血，因此我国、欧盟和美国等多个国家将其列为禁用药物［1－3］。同时规定了TAP、FF及其代谢产物氟苯尼考胺（FFA）在动物源性食品中最大残留量（MRL），TAP的MRL为50μg／kg，FF和FFA在家禽肌肉中的MRL为100μg／kg，而家禽产蛋期间禁止使用这些药物。由于家禽生产发展的需要，使用抗生素可以减少家禽疾病和死亡，但动物源性食品中抗生素残留成为人们必须关注的问题。

近年来，常有报道禽蛋中过度使用FF和FFA，导致FF和FFA残留在禽蛋中，影响人类健康。目前，CAPs药物的检测方 法主要包括：液相色谱法［4－7］、气相 色 谱 法［8－10］、液－质 联 用 法［11－15］和 气－质 联 用法［16－17］。相比现在报道的方法，本研究采用了加速溶剂萃取（ASE）对样品进行了前处理，以甲醇∶氨水∶水溶液（97∶2∶1，V／V）为萃取剂，正己烷去脂，通过液相色谱－串联质谱法同时检测鹌鹑蛋和鸽蛋中CAP、TAP、FF和FFA多药物残留。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

Waters Alliance e2695高效液相色谱仪（美国，Waters公司）；AB SCIEX Triple QuadTM5500四极杆串联质谱仪（美国，AB SCIEX公司）；ScanSpeedVac40离心浓缩仪（丹麦，Telstar公司）；ASE35加速溶剂萃取仪（美国，Thermofisher公司）。

CAP（纯度99．3%）、TAP（纯度99．0%）、FF（纯度99．0%）和内标CAP－D5（纯度99．0%）（德国Labor Dr．Ehrenstorfer Gmbh有限公司）；氟苯尼考胺（FFA）标准品（纯度99．3%，德国 WITEGA Laboratorien Berlin－Adlershof Gmbh有限公司）。FFA先用1mL超纯水溶解，其它药物标准品直接用乙腈溶解，再用乙腈定容至10mL，充分摇匀，分别配制成200．00mg／L标准贮备液，分装，密封后，置于－70℃超低温冰箱中保存。取25μL同位素内标贮备液（100．0mg／L），用乙腈溶解并定容至10mL，充分摇匀，配制成250μg／L的同位素内标工作液，密封后，置于4℃冰箱中避光保存。每天用储备液制备不同浓度的工作液，现配现用。乙腈、甲醇（色谱纯，美国Tedia有限公司）；其他试剂均购买于国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水。

1．2 样品前处理

准确称取5．0g匀浆后的样品放于研钵中，并加入4．0g硅藻土研磨，为了达到最佳的萃取效率，尽可能将样品研磨成小颗粒后，装入22mL的萃取池中，设置参数：温度为80℃，压力为1．034×104kPa，静态萃取时间5min，冲洗溶剂（甲醇∶氨水∶水溶液（97∶2∶1，V／V／V））的总量为40%（占萃取池体积的40%），每个样品之间自动冲洗1次，氮气吹扫60s，静态萃取1次，萃取液收集于60mL收集瓶中。收集的萃取液转移至50mL离心管中，置于50℃离心浓缩仪（2 000×g）上吹至1～2mL后，加入1mL乙腈，漩涡振荡混匀1min，加入10mL正己烷（用乙腈饱和）漩涡混匀，去脂，静置5min，弃去上层正己烷，下层提取液重复提取一次，然后置于50℃离心浓缩仪（2 000×g）上吹干，冷冻保存。上机前用5mL 40%乙腈分两次漩涡振荡溶解，12 100×g离心15min，过0．22μm有机相针式滤器，滤液待上机分析检测。

1．3 LC－MS／MS分析条件

色谱柱：Waters XBridgeTMC18柱（250×4．6mm，5μm），流动相：A相为2mmol／L NH4Ac溶液，B相为2mmol／L NH4Ac－乙腈溶液；0～3min，60%～10%A；3～8min，10%A；8～10min，10%～60%A。流速：0．8mL／min；柱温25℃；进样体积：10μL。梯度洗脱程序：质谱采用电喷雾电离，正、负离子扫描（ESI＋／ESI－）；多反应监测（MRM）模式检测；电喷雾离子化电压（IS）：5 500V（ESI＋）、4 500V（ESI－）；离子源温度：500℃；离子源喷雾气（Gas1）：3．103×105Pa（ESI＋）、3．447×105Pa（ESI－）；辅助加热气（Gas2）：3．447×105Pa（ESI＋）、2．413×105Pa（ESI－）；气帘气（CUR）：1．034×105Pa（ESI＋）、1．379×105Pa（ESI－）。CAP、TAP、FF、FFA和CAP－D5的保留时间和其它质谱参数见表1。

表1 CAP、TAP、FF和FFA的MS／MS条件和保留时间Table 1 MS／MS conditions and retention time of CAP，TAP，FF，FFA and CAP－D5

2 结果与讨论

2．1 萃取条件的优化

2．1．1 萃取压力和温度 ASE使用的压力远高于将溶剂保持在其液态所需的阈值，改变压力对分析物回收率的影响很小，因此不需要进行压力调节，压力一般在1．034×104kPa左右［18］。本实验在1．034×104kPa下，考察了不同萃取温度（40、60、80、100、120℃）对萃取效率的影响。当萃取温度为80℃时，样品的萃取回收率最高。因此选择80℃为最佳萃取温度。

2．1．2 萃取剂的选择 本实验在1．034×104kPa和80℃下，比较了不同的萃取剂乙酸乙酯∶乙腈∶氨水（49∶49∶2，V／V／V）［4，14］、甲醇∶水（97∶3，V／V）和甲醇∶氨水∶超纯水（97∶2∶1，V／V）对样品回收率的影响。结果表明，甲醇∶氨水∶超纯水（97∶2∶1，V／V／V）作为萃取剂时，目标化合物的回收率最高。因此，选择甲醇∶氨水∶超纯水（97∶2∶1，V／V／V）作为萃取剂。

2．2 LC－MS／MS条件的选择

2．2．1 LC条件优化 液相色谱检测动物源性食品中 CAPs药物残留多采用 C18柱［4，6，11－15］，因此本实验采用Waters XBridgeTMC18柱（250×4．6mm，5μm）。考虑到FFA是弱碱性的药物，酸性流动相可以促进其电离，同时又能提高分析的灵敏度，因此以乙腈－0．1%甲酸作为流动相进行LC－MS／MS测定。结果表明甲酸的使用改善了FFA的响应和峰形，但是在负模式下监测的CAP、TAP和FF的离子产生了抑制。Barreto等报道的方法［12］，在ESI－下，CAP、TAP、FF获得令人满意的保留时间，但FFA在C18柱上保留较差。本实验也发现FFA在C18柱上保留较差，解决这一问题的方法是通过在两种流动相组分中分别添加2mmol／L NH4Ac来实现的，改善FFA保留并减少由基质组分引起的干扰。

2．2．2 MS／MS条件优化 50ng／mL的CAP、TAP、FF及CAP－D5采用ESI－模式和50ng／mL的FFA采用ESI＋模式对目标分析物进行全扫描（Q1Scan），确定其各自的母离子［M－H］－和［M＋H］＋，与文献报道一致［12－14］。然后进行二级质谱扫描，每种组分分别选取丰度最高且互不干扰的两个作为子离子，并将基峰作定量离子。优化质谱参数见表1。

2．2．3 色谱分离 在优化的LC－MS／MS条件下，测得鹌鹑蛋中CAP、TAP、FF、FFA的保留时间分别为4．92、3．93、4．93和3．49min；鸽蛋中的保留时间分别为4．94、3．93、4．94和3．48min。所得色谱峰峰形好。以鹌鹑蛋色谱图为例，图1为空白样品色谱图，图2为加标样品色谱图。

2．3 标准曲线

用空白基质溶液稀释混合标准工作溶液，配制相应的标准系列溶液（CAP：0．1、0．5、1．0、5．0、10．0、15．0、20．0、25．0μg／kg；TAP：1．0、5．0、10．0、25．0、50．0、75．0、100．0、150．0μg／kg；FF：0．3、1．0、10．0、50．0、100．0、150．0、200．0、250．0μg／kg；FFA：1．5、5．0、10．0、50．0、100．0、150．0、200．0、250．0μg／kg；CAP－D5：5．0μg／kg），将每个混合浓度点依次由低浓度到高浓度进行LC－MS／MS检测。以空白基质样品中的分析物浓度为横坐标（x），定量离子与同位素内标离子的峰面积比值为纵坐标（y），绘制标准曲线（表2）。以空白基质溶液逐级稀释每个药物的浓度，进行LC－MS／MS检测，以信噪比（S／N）为3和10时所对应的浓度分别作为药物的检测限（LOD）和定量限（LOQ），结果见表2。

表2 鹌鹑蛋和鸽蛋中CAP、TAP、FF、FFA回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限Table 2 The regression equations，correlation coefficients，linear ranges，limits of detection（LODs）and limits of quantitation（LOQs）of CAP，TAP，FF and FFA in quail eggs and pigeon eggs

图1 空白鹌鹑蛋样品的总离子流（TIC）和提取离子（EIC）色谱图Fig．1 TIC and EIC chromatograms of CAP，TAP，FF，FFA and CAP－D5in a blank quail egg sample

图2 空白鹌鹑蛋样品中添加CAP、TAP、FF、FFA和CAP－D5 的总离子流（TIC）和提取离子（EIC）色谱图Fig．2 TIC and EIC chromatograms of spiked 0．3μg／kg for CAP，5．0μg／kg for TAP，10．0μg／kg for FF and FFA，and 5．0μg／kg for CAP－D5in a blank quail egg sample

2．4 添加回收率和精密度

测定每个药物的LOQ、0．5倍MRL、1倍MRL和2倍MRL浓度下的回收率，测定6次并求其平均值。将回收率检测剩余的样品混合成4个浓度点在1d内不同时间6次重复测定，求平均值，计算日内精密度。在一周内6次重复测定，求平均值，计算日间精密度。测定鹌鹑蛋和鸽蛋中氯霉素类药物添加回收率及精密度，结果见表3和表4。

表3 鹌鹑蛋中CAP、TAP、FF和FFA的添加回收率和精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and precision for CAP，TAP，FF and FFA analysis in to quail egg（n＝6）

（续表3）

表4 鸽蛋中CAP、TAP、FF和FFA的添加回收率和精密度（n＝6）Table 4 Recoveries and precision for CAP，TAP，FF and FFA analysis in pigeon egg（n＝6）

将所建立的方法与相关文献方法［4，9，13－14］进行比较，本文建立的 ASE／LC－MS／MS法能节省前处理时间、灵敏度高、回收率高，具有简便、高效、快速等优势，因此可作为检测鹌鹑蛋和鸽蛋中氯霉素类药物残留的有效方法。

3 结论

建立了ASE／LC－MS／MS方法检测鹌鹑蛋和鸽蛋中CAP、TAP、FF和FFA多药物残留，为动物源性食品中氯霉素类药物多残留检测提供了新的技术手段。该方法灵敏、快速，满足欧盟、美国和我国农业部对氯霉素类药物多残留检测的要求。