花期铺膜对蛇龙珠果实及酒品质的影响

王 瑜，于素珍，肖慧琳，郑秋玲，王 婷，刘万好，曹志毅，唐美玲*

（1.烟台大学 生命科学学院，山东 烟台 264005；2.山东省烟台市农业科学研究院，山东 烟台 265500；3.威海市神山葡萄科技有限公司，山东 威海 264417）

“七分原料，三分酿造”指出酿酒葡萄果实品质是酿造优质葡萄酒的基础。因此很多栽培措施都是围绕如何提高酿酒葡萄果实品质来进行的。近年来，果际微气候调控是国内外的研究热点，尤其是摘叶研究[1-3]较多，但目前国内对酿酒葡萄进行铺膜研究较少。大多是对鲜食葡萄进行铺膜处理[4-5]，结果均表明铺设反光膜可增加果实中的可溶性糖和花色苷含量。而国内外对酿酒葡萄进行铺膜处理的研究表明，铺膜处理都对酿酒葡萄果实及酒的品质有不同程度的积极影响。李红燕等[6]在树冠下对赤霞珠进行铺设银色反光膜处理，结果表明铺膜提高了可溶性固形物及糖的含量；OSRECAK M等[7]在萨格勒布大学实验田分别对雷司令、塔明娜和白曼左尼在转色期进行铺设铝制反光膜处理，结果表明三种葡萄酒中的总酚和黄酮醇含量都有所增加，其中对雷司令进行铺膜处理的影响最显著；COVENTRY J M等[8]在加拿大安大略省的尼亚加拉葡萄基地对品丽珠葡萄从花期前就进行铺设铝化聚乙烯薄膜处理，结果表明葡萄中的可溶性固形物、糖、总酚、黄酮醇及花色苷的含量都有不同程度的提升，其中黄酮醇的含量增加的程度高达未处理的36%。除此之外，铺设反光膜还能减少有害昆虫的数量，特别是蚜虫和叶蝉，还可以抑制杂草的生长，减少了人力或者药用除草的成本。

蛇龙珠是烟台产区主栽的酿酒葡萄品种，抗病性、抗旱性、抗抽干能力较好，但稳产性差、果粒偏大、降酸太快等缺点也比较突出，因此结合烟台产区气候特点以及蛇龙珠品种特性，本研究在花期对蛇龙珠进行铺膜处理，研究铺膜对果实和葡萄酒品质的影响，为后期研究蛇龙珠配套栽培技术提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验在烟台产区蓬莱市龙湖酒庄进行。选择树龄4年的蛇龙珠（CabernetGernischt），南北行向，行距2m，株距1m，采用单干单臂+直立叶幕整形。土壤为棕壤土，肥力中等。

丙酮、硫酸铜、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚甲基蓝、无水碳酸钠、钨酸钠、钼酸钠、磷钼酸、单宁酸、氯化钾、没食子酸等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷及二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷（纯度均＞98%）：上海M iragen公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、甲酸（分析纯）：上海安谱实验科技股份有限公司；安琪CECA葡萄酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent1260 Infinity高效液相色谱仪、AA-56311有机相过滤器：安捷伦科技（中国）有限公司；GCMS-QP2010Ultra气相色谱质谱联用仪：日本津岛公司；AL204分析电子天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；IKA MS3 basic涡旋振荡器：艾卡仪器设备有限公司；Centrifuge5430R高速离心机：德国Eppendorf公司；H13237型超纯水器：四川优普超纯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验处理及采样

实验处理：选取长势良好一致的植株，每10棵树为一个处理，重复3次，各处理随机排列。花期对葡萄藤下进行铺设反光膜处理，反光膜采用比利时博优国际集团下属的博优技术纺织品（威海）有限公司生产的Lumilys L25反光地布，葡萄树两边各铺设40 cm，中间用园艺布钉连接。

采样时间及检测项目：从果实着色期（7月27日）开始到采收期（10月8日），间隔7～10 d采样一次，共采样7次，检测总酚、花色苷、单宁及花色苷单体含量；采收期的葡萄分别用10 L玻璃罐进行葡萄酒酿造，检测葡萄酒品质的各项指标。

采样原则：当天上午10：00～11：00采样，分为上中下三部分平均采样，随机取样200粒浆果，样品采集后放入冰盒带回实验室，一部分直接放入-40℃冰箱内备用，测定还原糖和可滴定酸含量；一部分剥取果皮放入液氮中速冻，然后用研钵磨成粉末放入真空冷冻干燥机-40℃条件下冷冻干燥24 h，果皮粉保存在-40℃冰箱内备用。

1.3.2 果实品质指标的检测方法

总酚含量（以没食子酸计）的测定用福林肖卡法[9]；总花色苷含量（以二甲花翠素葡萄糖苷计）的测定用pH示差法[10]；单宁含量（以单宁酸计）的测定用福林丹尼斯法[11]。

选择6个采样时间（完全着色后至成熟期每7个工作日采样一次）对葡萄果实进行花色苷总量和单体检测，提取样品果皮0.2 g加入1.5m L甲酸甲醇提取液后，研磨振荡10min，离心后取上清液1m L用0.2μm滤膜过滤后，进行高效液相色谱法检测[12]。

1.3.3 葡萄酒的酿制

成熟期采收后对处理及未处理的‘蛇龙珠’葡萄进行除梗后人工挤破压碎，分别倒入10L玻璃罐，然后加入1000mg的CECA酿酒酵母及60mg/L的亚硫酸；在25℃条件下进行浸渍10 d（发酵过程中每日进行搅拌，让上层的悬浮葡萄皮渣充分浸泡）；浸渍结束后使用纱布挤压过滤，在玻璃罐中沉降7 d后分装到酒瓶里进行打塞存储。

1.3.4 葡萄酒品质指标的检测方法

总酚含量（以没食子酸计）用福林肖卡法[9]；总花色苷（以二甲花翠素葡萄糖苷计）用pH示差法[10]；单宁含量（以单宁酸计）的测定用福林丹尼斯法[11]；pH用pH计测定，酒精度用蒸馏法测定。

1.3.5 葡萄酒香气成分的测定

用顶空固相微萃取法（headspace solid-phasemicroex traction，SPME）对香气成分进行萃取浓缩。SPME萃取头在使用前250℃老化30min，葡萄酒取5m L样品置于20mL顶空瓶中，加入10μL 50μg/m L的2-辛醇（内标），将老化后的50/30μm CAR/PDMS/DVB萃取头插入样品瓶顶空部分，于45℃吸附30min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250℃解吸3min。

GC-MS条件：载气为纯度99.9%的氦气（He），流速为1m L/min。气相色谱的顶空进样口温度为220℃，离子检测器温度为280℃，离子源温度为230℃，连接线温度为280℃。柱箱升温程序为40℃保持2min后以3℃/min升温到150℃保持2min，然后以10℃/min升温到220℃保持2min。采集数据后经MS-DIAL program 3.40软件解卷积处理并计算保留指数，得到各保留时间的化合物名称，峰面积及保留指数。

1.3.6 花色苷单体的测定

高效液相色谱条件：KromasilC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流速1.0m L/mim；柱温30℃；进样量20μL；检测波长525 nm；流动相A甲酸∶水=1∶9，流动相B甲酸∶乙腈=1∶9。

采用外标法进行定性和定量分析。准确称取花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷这5种标准品，用10%的甲酸溶液配制成质量浓度为10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准溶液，经0.22μm滤膜过滤后，在确定的色谱条件下上机测定，拟合5种花色苷的质量浓度（Y）和峰面积（X），得到标准曲线方程进行定量分析。相关系数均在0.999 2以上，线性关系良好，符合高效液相色谱的标准。其他各类酰化花色苷参考梁振昌[13]的测定结果推断色谱峰代表成分。

1.3.7 数据处理

采用Excel2010和IBM SPSSstatistics24软件的单因素分析对实验数据进行显著性分析，显著性水平P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 花期铺膜对蛇龙珠果实风味物质累积动态的影响

2.1.1花期铺膜处理对果实总酚和单宁累积动态的影响

经检测没食子酸的标准曲线回归方程为y=2.976 6x-0.025 6，相关系数R2=0.999 6，所得总酚的积累动态见表1。由表1可知，花期铺膜改变了蛇龙珠果实中总酚累积的变化趋势。在本研究7个取样时期中，花期铺膜处理总酚呈现先升高达到最大值8.15 g/kg再降低到6.98 g/kg再升高至7.99 g/kg再降低至采收期的4.94 g/kg的趋势，而对照组呈现先升高至8.24 g/kg再降低的趋势。其中在9月18日和9月25日这两个时期的经过花期铺膜处理的总酚含量显著增加（P＜0.05），分别是对照组的1.07倍和1.39倍，但在采收期（10月8日）处理和对照总酚含量基本相同。而从表1中能够得到花期铺膜处理对葡萄总酚含量除了在9月18日和9月25日外其他时期都没有达到显著差异的影响（P＞0.05），因此，花期铺膜只是改变了变化趋势，对总酚合成没有显著的影响，这与TODIC S等[14]对赤霞珠进行铺设白色反光膜处理后测定总酚含量无影响的结果是一致的。

表1 不同时期花期铺膜与对照的总酚和单宁含量的对比Table 1 Comparison of totalphenoland tannin contentbetween reflective film in flowering stage and controlin differentperiods

经检测单宁酸的标准曲线为y=0.0829x+0.0087，相关系数R2=0.995，所得单宁积累变化趋势见表1。花期铺膜果实中单宁含量的变化总体趋势为逐渐降低，自7月27日达到最大值3.49g/kg，随后逐渐降低，一直到采收时（10月8日）达到最低值1.46g/kg；而对照组单宁含量变化趋势为先升高，至8月29日达到最大值，随后在9月9日降低至最低值1.62 g/kg，之后一直比较平稳。7月27日-8月21日和8月29日-9月25日这两个时间段之间，花期铺膜果实中单宁含量一直都是高于对照的，但是仅在9月18日达到了显著差异（P＜0.05）。而且在采收时期，铺膜处理的单宁含量低于对照的单宁，这与于咏等[15]的研究结果一致。由此可见，花期铺膜对蛇龙珠的单宁的积累没有显著影响（P＞0.05）。

2.1.2 花期铺膜处理对果实花色苷动态积累的影响

选择了6个采样时期通过液相色谱法测定果皮中花色苷含量以及变化趋势如表2所示。由表2可知，花期铺膜和对照组中花色苷含量都是逐渐升高的，花期铺膜没有改变花色苷累积的变化趋势。其中花期铺膜处理果实中花色苷含量在采收期达到最大值7.71 g/kg，而对照组则是先升高随后缓慢的降低然后再逐渐升高的趋势，在采收期达到最大值6.06 g/kg；在本研究的6个采样时期中，后4个时期的花期铺膜的花色苷含量都是极显著高于对照组（P＜0.01），在9月25日的花期铺膜的花色苷含量比对照提高了44.53%。本研究表明花期铺膜对促进花色苷合成具有积极作用，这与王立如等[5-6，16-17]的研究结果均一致。

表2 不同时期花期铺膜与对照的花色苷含量的对比Table 2 Comparison of anthocyanin content between reflective film in flowering stage and control in different periods

2.1.3 花期铺膜对果实中花色苷单体组成的影响

选择采收期的果实进行花色苷单体检测，结果如表3和表4所示。由表3可知，烟台产区蛇龙珠果实中检测出13种花色苷单体，这与其他地区检测出的蛇龙珠单体数有明显差异，如宁夏玉泉营[18-19]和甘肃省祁连地区[20]的蛇龙珠果实均检测出了9种花色苷单体，山西乡宁县地区[21]检测出了15种，每个产区的花色苷单体数量均不相同，这说明花色苷单体的种类数量可能与不同产区有关系。花期铺膜处理果实中只检测出12种花色苷单体，比对照减少了花翠素-3-O-葡萄糖苷-5-O-香豆酰化葡萄糖苷单体。

表3 成熟时期花期铺膜与对照的花色苷单体的分析Table 3 Analysis of anthocyanin between reflective film in flowering stage and control in mature periods

花期铺膜和对照组均检测出10种单葡萄苷花色苷，花期铺膜处理果实中检测出2种双葡萄糖苷花色苷，对照果实中检测出3种双葡萄糖苷花色苷，二者共同检测出的双葡萄糖苷花色苷是花青素-3-O-香豆酰化-5-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-咖啡酰化-5-O-葡萄糖苷。虽然大多数研究表明，欧亚种葡萄只能以单葡萄糖苷花色苷形式存在，但是也有少数的研究表明部分欧亚种也存在双葡萄糖苷[22-24]。另外，花期铺膜组的二甲基花翠素类、香豆酰化花色苷、乙酰化花色苷以及咖啡酰化花色苷含量高于对照组，其余花色苷含量均低于对照组。

表4 成熟时期花期铺膜与对照的花色苷相对含量的对比Table 4 Comparison of the relative content of anthocyanin between reflective film in flowering stage and control in mature period%

烟台产区蛇龙珠花色苷分为五类：花翠素类、花青素类、甲基花翠素类、甲基花青素类和二甲基花翠素类。由表4可知，花期铺膜和对照中含量最高的均是二甲基花翠素类，其次是甲基花翠素类，这与这与何英霞等[25]的研究结果一致。因为数据只能以相对含量显示，但在总花色苷含量的对比中花期铺膜处理显著高于对照组（P＜0.05），所以二甲基花翠素类花色苷的含量也是明显高于对照的。

2.2 花期铺膜处理对葡萄酒品质的影响

2.2.1 花期铺膜对葡萄酒的理化指标及总酚、总花色苷和单宁含量的影响

由表5可知，花期铺膜对葡萄酒单宁含量影响极显著（P＜0.01），含量为527.08mg/L，是对照的1.23倍；花期铺膜葡萄酒中花色苷含量为3 268.80mg/L，仅比对照增加了7.32%；总酚仅是稍有增加，这与SANDLERH A[26]的研究结果相一致。花期铺膜果实酿造的葡萄酒pH值较高，为4.15，而对照的为4.05，这与王辉等[27]的研究结果一致；花期铺膜葡萄酒酒精度为14.2%vol，比对照高了2.2%vol。

表5 花期铺膜与对照的葡萄酒中各指标含量的对比Table 5 Comparison of the contentof various indicators between reflective film in flowering stage and controlwines

2.2.2 花期铺膜对葡萄酒中香气成分的影响

对蛇龙珠葡萄酒香气成分进行检测，结果如表6所示。由表6可知，花期铺膜对酒中香气种类没有影响，均检测出130种香气物质，其中包含醇类30种、醛类7种、酮类15种、酯类59种、酸类9种和萜烯类10种。但处理对香气物质含量有影响，除了醛类外其余的主要香气物质的总量均高于对照。其中含量最高的是醇类物质，花期铺膜处理的酒中醇类物质的含量高达6 832.71μg/L，占总含量的41.63%；而对照的是5 342.23μg/L，占总含量的38.45%，花期铺膜处理是对照的1.28倍。花期铺膜处理的葡萄酒中有呈现特殊橙花香和玫瑰花香气的物质如1-辛醇、1-壬醇及1-癸醇[28]含量明显高于对照组。

表6 花期铺膜与对照的酒中各类香气组分含量的对比Table 6 Comparison of the content of various aroma components between reflective film in flowering stage and controlwines

续表

其次是酯类物质，铺膜处理组含量为5 780.86μg/L，对照组为4 978.27μg/L。酯类香气物质中处理和对照的酒最高含量的均为具有果香、茴香味和甜味的辛酸乙酯，分别高达1 927.05μg/L和1553.19μg/L。两种酒中均检测出有特殊果香成分的乙酸乙酯、丙酸乙酯及丁酸乙酯等物质，还有乙酸甲酯、乙酸正壬及月桂酸甲酯这类具有茴香味和花香味的物质，另外还有具有白兰地风味的壬酸乙酯和辛酸异戊酯，具有蘑菇香味的乙酸正壬酯以及具有舒适醋味和脂肪香味的癸酸乙酯等物质。这些特殊的酯类香气物质大多数都是处理含量比对照的高，这说明花期铺膜处理能够在一定程度上促进酒中花香、果香及特殊香气的酯类物质的积累，这与ROSSO C[29]研究结果一致。

铺膜处理组和对照组的萜烯类化合物含量分别为3219.87μg/L和3019.54μg/L。在萜烯类香气物质具有特殊柠檬味和玫瑰味的物质为芳樟醇、松油烯-4-醇、α-萜品醇、香叶醇和反式-橙花叔醇，虽然含量不高但是花期铺膜处理过的酒样中均高于对照酒样。其中尤其重要的组分就是芳樟醇，它是一种单萜烯醇，有助于散发酒中浓郁的花香[30]，铺膜处理的葡萄酒中含量是未处理的1.54倍，这与SASAKI K等[31]研究结果一致。含量相对较少的几类就是酮类、醛类及酸类，并且有特征香气的物质含量大多数都是处理高于对照，如有奶油香气的3-羟基-2-丁酮的含量甚至高达对照的5倍。3结论

花期铺膜能够显著增加烟台产区‘蛇龙珠’果实和葡萄酒中的总花色苷含量并且能够促进花色苷中主要的单体—二甲基花翠素类花色苷的合成；还能够提高葡萄酒中主要香气物质的含量以及促进特殊香气物质的合成，尤其是醇类、酯类和萜烯类的特殊香气物质；对于酒的品质调控方面也有积极影响，但不是每个指标都差异显著。其中铺膜处理对果实中总酚和单宁的含量没有显著的影响（P＞0.05）。由此可见，铺膜处理不是对所有品质指标都有积极影响，因此一定要深入了解葡萄品种在当地需要改善哪些品质指标之后，再探索寻找最经济适用的果际微气候调控措施。