桑树桑黄人工繁育技术研究

刘 艳 黄传书 赵 珮 雷 霆 宋志光 邢康康

(1.重庆市蚕业科学技术研究院，重庆400700；2.重庆市中药研究院，重庆400065)

桑黄是一种珍贵的药用真菌，作为中药入药已有2000多年的历史，在《本草纲目》《神农本草经》《中药大辞典》中均有详细记载，是中国最有发展前景的药用真菌之一，有“森林黄金”之美称[1]。现代研究表明，桑黄具有抗癌、抗肿瘤、保肝、降血糖、免疫调节等作用。桑黄因其多糖能显著抑制肿瘤生长和转移，且对人体不良反应小，是目前国际公认的生物治癌领域中效率最高的真菌。目前桑黄菌种包括鲍氏针层孔菌(phellinusbaumii)、火木针层孔菌(phellinusigniarius)、裂蹄针层孔菌(phellinuslinteus)、瓦宁纤孔菌(Inonotusvaninii)[2-6]。市场上供应的主要有桑树桑黄、杨树桑黄、暴马丁香桑黄、桦树桑黄、松树桑黄等。桑树桑黄的多糖、 黄酮和三萜类含量均高于其他树种，因此桑树桑黄为极品，价格最高[7-9]。随着人们健康意识不断提高，对高品质桑黄产品需求逐渐增大，目前野生桑黄资源匮乏，远不能满足人们对高品质桑黄的需求。因此人工栽培桑树桑黄具有广阔的市场前景，进行适宜桑树桑黄菌种筛选及人工繁育技术研究，对桑树桑黄规模化和产业化十分重要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌种

桑黄菌株1、2、3、4号，来源于金寨尚臻生物科技有限公司。

1.1.2 代料配方原料

桑树木屑、玉米粉、稻皮、棉籽壳、熟石膏。

1.2 方法

1.2.1 培养基制作方法

1.2.1.1 母种培养基

(1)配料：葡萄糖20g、琼脂20g、鲜马铃薯200g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、水1000mL。

(2)制作方法：将鲜马铃薯称量水煮搅碎过滤去渣，再与上述其他配料均匀混合，放入高压蒸汽灭菌锅，在0.11MPa、121℃条件下，灭菌20min。

1.2.1.2 原种培养基

(1)配料：主料按桑树木屑78%、稻皮20%、石膏粉2%，水分占总质量55%。

(2)制作方法：将上述配料混合均匀，装袋后扎好口，放入高压蒸汽灭菌锅，在0.11MPa、123℃条件下，灭菌50min。

1.2.1.3 栽培种培养基

(1)配料：主料按桑树木屑78%、稻皮20%、石膏粉2%，水分占总质量55%，pH值控制在6～7。

(2)制作方法：将上述配料混合均匀，装袋后扎好口，放入高压蒸汽灭菌锅，在0.11MPa、121℃条件下，灭菌50min。

1.2.2 菌种培养方法

1.2.2.1 母种培养

将桑黄菌株1、2、3、4号分别接种到母种培养基斜面中，在温度25℃、湿度65%条件下，避光培养7～10d，菌丝长满斜面培养基。

1.2.2.2 原种培养

将上述母种分别接入含有原种培养基的菌袋中，放入人工气候箱中，在温度25℃、湿度65%条件下，避光培养，隔天观察，记录菌丝粗细及颜色变化情况，菌袋长满的时间。

1.2.3 适宜桑树桑黄菌株的筛选鉴定

1.2.3.1 适宜桑树桑黄菌株筛选

桑黄菌株1、2、3、4号的母种分别接入含有原种培养基的菌袋中，在相同条件下培养至菌丝长满菌袋，观察菌丝颜色变化、粗细、生长速度，筛选适宜菌株。

1.2.3.2 适宜桑树桑黄菌株鉴定

(1)形态鉴定

将适宜桑树桑黄菌株接种到含有母种培养基的平皿，在温度25℃，湿度65%条件下，避光培养7d左右，观察菌落形态。

(2)rDNA ITS分子鉴定[10]

将适宜桑树桑黄菌株抽提DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA抽提结果。设计ITS序列引物，将抽提的DNA进行PCR扩增。产物纯化后琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。获得的序列经进行BLAST比对，结合形态学特征，确定分离菌种的分类地位。

(3)DNA序列分析及系统发育树构建

将测序获得的ITS序列通过BLAST比对，根据同源性相似度差异，利用Clustal X(Version 1.83)软件进行多序列匹配排列，用软件MAFFT version 7，邻接法(Neighbour-Joining，NJ)构建系统发育树，对桑黄菌株3号与Genebank数据库中登录的近源菌株系统发育关系进行分析。

1.2.4 桑黄代料制作

1.2.4.1 桑黄代料配方的筛选

为优化桑黄代料配方，本试验通过参考其他相关研究及预试验情况，设计桑树木屑、玉米粉、稻皮、棉籽壳、熟石膏比例范围分别为：桑树木屑40%～85%，玉米粉2%～20%，稻皮2%～25%，棉籽壳10%～17%，熟石膏1%～3%(见表1)。在此范围内设置20组配方，按相同培养条件，观察分析适宜代料配方。

1.2.4.2 桑黄代料的制备

将筛选物料按照实验设计的比例混合，加入55%水，装袋后扎好口，放入高压蒸汽灭菌锅，在0.11MPa、123℃条件下，灭菌50min冷却，将筛选出的适宜桑树桑黄菌种接入代料，放入人工气候箱培养，温度保持28℃，湿度保持60%～75%，桑黄菌丝一般60d左右长满菌袋。

表1 实验因素和水平表

1.2.5 桑黄子实体培养

菌丝体长满栽培袋后，等黄色变棕色时，在颜色最深处割口出黄，出黄温度30℃～33℃，85%～95%湿度，300lx光照条件下培养30～60d，见子实体生长圈颜色变深开始干燥不再生长时采收。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选

桑黄菌株1、2、3、4号的母种分别接入含有原种培养基的菌袋中，在相同条件下培养至菌丝长满菌袋，均未出现污染。桑黄菌株1号培养71d菌丝长满菌袋，颜色浅黄，菌丝较粗；2号培养63d菌丝长满菌袋，颜色深黄，菌丝较细；3号培养50d菌丝长满菌袋，颜色深黄，菌丝较粗；4号培养67d菌丝长满菌袋，颜色浅黄，菌丝较粗。试验结果表明桑黄菌株3号比其他3种生长速率快、菌丝较粗，更适合用桑树木屑培养。如表2所示。

表2 四株桑黄菌菌丝生长情况

图1 瓦宁纤孔菌菌落形态

2.2 菌株鉴定

如图1所示，桑黄菌株3号在PDA平板上形成的菌落为圆形，气生菌丝绒毛状，星状放射生长；菌丝初期为白色，后逐渐变为淡黄色、黄色至深褐色。经ITS区测序，BLAST比对，综合鉴定结果为瓦宁纤孔菌(Inonotusvaninii)。

2.3 分子系统学分析

根据桑黄菌株3号测定的ITS序列与Genebank数据库中登录的近源菌种结果，桑黄菌种3号的ITS序列与瓦宁纤孔菌、鲍式木层孔菌相似度均为100%，结合Genebank上的8个桑黄菌种有关序列进行了系统发育树构建．分枝统计支持率评估采用Bootstrap法，自展值为1000。由图1可知，所有序列形成两个大的分支，分别是纤层孔菌和针层孔菌，而桑黄菌种3号与瓦宁纤孔菌遗传距离(亲缘关系)最近，见图2。

图2 桑黄菌种3号系统进化树

2.4 优选代料配方分析

如表3所示，本试验对20组代料配方进行比较试验研究。20组均成活，其中平均产量最高、菌丝生长速率最快是第4组，而桑枝木屑含量最高的14组平均产量却并不是最高，说明桑枝木屑并不是越高越好；第4组玉米粉含量较高，木腐菌瓦宁纤孔菌，不仅以桑枝木屑、稻皮、棉籽壳的纤维素和木质素作为碳源，还可利用玉米粉中的糖类物质。根据试验结果推测，玉米粉为瓦宁纤孔菌提供了丰富的维生素、磷、钙和铁，有利于桑黄的生长繁育。

表3 优化代料配方试验结果

3 讨论

本试验在桑黄菌株和代料培养配方方面进行了研究。从现有的四种桑黄菌株中，筛选出了以桑枝木屑作为主要营养物质的适宜菌株，经形态学结合分子生物学鉴定为瓦宁纤孔菌。大多数文献集中报道了瓦宁纤孔菌以杨树作为寄主，而以桑树作为寄主鲜有报道。设计了20组配方，按照配方比例进行试验，从中筛选出了最佳配比，即桑树木屑80%、玉米粉10%、稻皮2%、棉籽壳7%、熟石膏1%。同时试验表明瓦宁纤孔菌可将玉米粉作为营养物质，推测玉米中的维生素、磷、钙和铁可能促进该菌的生长繁育，后续试验可做深入研究，以期进一步提高桑树桑黄的产量，为桑树桑黄的人工繁育和规模化栽培提供一定参考。