烟草炭疽病原研究及拮抗链霉菌鉴定

李继业，王璟晶，杨 露，彭丽娟

(1.贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025； 2.贵州省烟草品质研究重点实验室，贵州 贵阳 550025； 3.贵州大学 烟草学院，贵州 贵阳 550025)

烟草炭疽病是烟草主要苗期病害之一，由炭疽菌属(Colletotrichum)引起，在烟草的整个生育期均可发生[1]。发病省份遍布我国各个烟区，西南烟区发病尤甚。近些年，随着烟草育苗方式的改变，大田育苗改为漂浮育苗，且育苗管理措施更为完备，一部分烟草苗期病害得到控制，烟草炭疽病的发生情况也得到改变。2002年以前烟草炭疽病在中国平均发病率为30%～40%，发病严重的地区可达80%，且病情指数较高，严重影响烟草生产[2]。李昊[3]在2016年河南襄城县一现代化烟草育苗基地调查苗期病害，306株幼苗发病严重的有26株，有149株轻微发病，发病率较高，病情指数不高。台莲梅等[4]于黑龙江省绥化、肇州和宾县3个烟区调查苗期病害，烟草炭疽病平均发病率为5%。谭海文[5]调查了广西省10个县的苗期发病情况，烟草炭疽病仅在罗城及南丹县发生，发病率为2%～5%，病情指数仅为0.27～0.57。

一些研究发现，烟草炭疽病病原为毁灭炭疽菌(Colletotrichumdestructivum)[6-8]。Shen等[9]在加拿大发现，瓜类炭疽菌(Colletotrichumorbiculare)能引起烟草属的炭疽病。任文清等[10]在四川通过形态学鉴定了1株烟草炭疽菌(Colletotrichumnicotianae)。苗圃[11]在河南省分别报道了胶胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起烟草炭疽病。笔者于贵州省绥阳县采集烟草炭疽病病株，分离病原菌，编号为SY-TJ，用柯赫氏法则验证其致病性，并通过形态学和系统发育分析明确其分类地位。此外还对其进行了生物学特性的研究和生防链霉菌的筛选及鉴定，以期为该病害的预防及防治提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

烟草炭疽病标本，于2017年8月3日采自贵州省绥阳县，品种为云烟87；致病性测定采用成苗期烤烟幼苗，品种为云烟87；链霉菌分离土样采自贵州省湄潭县(N 27°58′55.47″ E 107°54′34.64″)烤烟根际土壤，以及采自贵州省贵阳市花溪区(N 26°29′34.75″ E 106°40′15.86″)林地中微生物含量丰富的地表土。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离

采用组织分离法[12]。用灭好菌的滤纸片吸干组织表面水分以减少细菌生长，置于添加硫酸链霉素(0.1 mg·mL-1)和氨苄青霉素钠(0.05 mg·mL-1)的PDA平板上，25 ℃条件下培养3～5 d。将生长出来的菌丝体接种到PDA平板进行纯化。

1.2.2 柯赫氏法则验证其致病性

待菌丝布满整个平板，用无菌水冲洗平板制备孢子悬浮液(浓度为1×103mL-1)，采用有伤和无伤2种接种方法。无伤接种直接将孢子悬浮液0.1 mL涂匀在幼苗叶片上；有伤接种采用2.5 mL注射器针头(直径0.55～0.60 mm)刺破幼苗叶片，将孢子悬浮液0.1 mL均匀涂抹在叶片伤口周围。置于25 ℃、湿度50%的光照培养箱中，对照组刺破叶片后采用清水处理。待叶片发病，从发病叶片分离病原，并与绥阳县致病病原在显微镜下进行形态学对比，确定其是否为同一种病原[13]。

1.2.3 病原菌的形态鉴定和系统发育分析

形态鉴定取15 d的病原培养平板。于显微镜下观察分生孢子和附着胞的形态，测量大小，进行形态学的比较[14-17]。

系统发育分析：将绥阳县分离的烟草炭疽菌序列与目前已报道的病原及近似种(包含模式种和部分模式菌株的DNA片段)进行多基因系统发育分析。多基因系统发育树包含ITS(核糖体内转录间隔区序列)[14]、GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶基因)[15]、CHS-1(查尔酮合酶基因)[16]、ACT(肌动蛋白基因)4个基因[17]，选用基因与序列号见表1。系统发育分析利用MEGA6.0软件通过最大似然法(ML)构件系统发育树[11]。

1.2.4 生物学特性研究

将供试菌株在PDA培养基平板上培养，用打孔器(直径7 mm)在菌落外缘相同半径的圆周上打孔，制成菌饼待用。生物学特性测定所用平板直径均为9 cm，每处理均重复3次。用十字交叉法测定菌落直径，2 d后开始测量菌落直径，每隔2 d观察1次。测定其对碳氮源的利用以及pH、光照、温度对其生长的影响[18]。

碳源利用试验以查氏培养基为基础培养基(查氏培养基配方中碳源为蔗糖)，分别加入与蔗糖等量的碳源(甘露醇C1、乳糖C2、麦芽糖C3、淀粉C4、果糖C5和葡萄糖C6)配制成不同的培养基。取菌饼于各处理培养基平板中央，置于25 ℃培养箱中光照黑暗各12 h交替培养。

氮源利用试验以查氏培养基为基础培养基(查氏培养基配方中氮源为硝酸钠)，分别加入与硝酸钠等量的氮源(尿素N1、草氨酸N2、硫酸铵N3、硝酸钾N4、氯化铵N5、甘氨酸N6和蛋白胨N7)，配制成不同的培养基。取菌饼分别接于不同氮源的培养基平板中央，置于25℃恒温培养箱中光暗交替培养。

表1 本研究中选择的4种基因和序列号

Table 1 Four genes and the accession numbers chosen in this study

种名Name菌株号Accession numberITSGAPDHCHS-1ACTC. asianumHKUCC∶10862JX010194JX010021JX009787JX009465CBS∶124960JX010193JX010017JX009871JX009546C. destructivumCBS 114801KM105219 KM105574KM105359KM105429 CBS 128509KM105214KM105569KM105354KM105424 C. fructicolaICMP∶12568JX010166JX009946JX009762JX009529ICMP∶17787JX010164JX009958JX009807JX009439C. gloeosporioidesIMI 356878 EU371022JX010056JX009818JX009531CBS953.97KM105214KM105569KM105284KM105424C. lentis CBS 127605KM105241KM105598KM105381KM105451 CBS 127604JQ005766 KM105597JQ005808JQ005829 C. orbiculareCBS 570.97NR152271KF178490KF178515KF178563CBS 173.59 KF178463KF178487KF178512KF178560C. tabacumCBS 124249KM105206KM105560 KM105346 KM105416CBS 161.53JQ005763KM105559 JQ005805JQ005826 C. utrechtenseCBS 135827KM105202KM105555 KM105342KM105412 CBS 135828KM105203 KM105556KM105343KM105413C. vignaeIMI 334960KM105182 KM105533 KM105252KM105392 C. pisicolaCBS 501.97CBS 724.97KM105183KM105172KM105534KM105522KM105253 KM105242KM105393KM105382

以上数据使用IBM SPSS软件分析处理间差异的显著性。

1.2.5 生防链霉菌的筛选

土壤中的链霉菌，按照梯度稀释分离法，土样预先在50～60 ℃烘干处理1 h抑制细菌的生长[19]，分离链霉菌菌株。将分离得到的链霉菌与烟草炭疽病病原菌进行室内平板对峙。选取效果较好的菌株进行复筛，25 ℃下培养，观察是否产生抑菌(溶菌)圈，定期测量抑菌(溶菌)圈的大小[20-21]。

1.2.6 生防链霉菌的分子鉴定

基于16S rRNA基因序列使用最大似然法(ML)构建系统发育树[19]。系统发育树基因选择NCBI中通过比对相似度较高的菌株序列。

1.2.7 生防链霉菌的生理生化指标的测定

生理生化指标的测定包含碳源利用、氮源利用、明胶液化、淀粉水解、纤维素水解、硫化氢产生、氧化酶产生、过氧化氢酶产生[22]。方法采用部分阮继生等[23]以及Evangelista-Martínez[19]所使用链霉菌生理生化实验改良方法。

2 结果与分析

2.1 致病性测定

接种病原SY-TJ后3 d，叶片产生发病症状，回接试验部分结果见图1。无伤接种的处理未见发病，有伤接种后发病较明显。接种病原菌后引起针刺部位周围叶片变黑，出现水渍状病斑，坏死部分为浅灰色，导致伤口扩大，说明该病原菌对烤烟品种云烟87有致病性。

A，刺破后不接种病原菌的处理；B，刺破后接种病原菌的处理；C，幼苗接种病原菌水渍状病斑放大图；D，接种后伤口扩大坏死病斑放大图；E，不接种病原菌叶片刺破伤口放大图。A， Non-inoculation of pathogeny after puncture; B， The treatment of inoculation of pathogeny after puncture; C， Water soaking spot; D， An enlarged picture of necrotic lesions after inoculation; E， An enlarged picture of punctures on leaf of non-inoculated pathogeny.图1 部分回接试验结果Fig.1 Results of pathogeny inoculation test

2.2 形态鉴定和系统发育分析

菌株SY-TJ菌落颜色为浅粉色，背面深黄色。分生孢子无色、单胞，整个孢子呈圆柱状，两端平滑钝圆，测量了30个分生孢子，计算了其平均数和标准差，长度为(13.5±2.3)μm，宽度为(6.1±1.7)μm。菌丝体附着胞深褐色，椭圆形，测量10个附着胞长(8.0±1.1)μm，宽(5.9±0.9)μm(图2)。

系统发育分析结果显示，SY-TJ与瓜类炭疽菌聚合在同一个进化分支(图3)。Shen等[9]的结果中，瓜类炭疽(C.orbiculare)分生孢子长(13.1±1.6)μm，宽(5.4±0.7)μm；菌丝体附着胞长(7.3±1.3)μm，宽(5.2±0.9)μm。结合形态学特征，将SY-TJ鉴定为瓜类炭疽(C.orbiculare)。

2.3 生物学特性

2.3.1 不同碳源对病原菌生长的影响

A与B分别为菌落正面与反面；C为附着胞形态；D为分生孢子形态。标尺=10 μm。The picture A and B were the front and the back of the pathogeny culture; The picture C was the morphology of appressorium; The picture D was the morphology of conidium. Bars=10 μm.图2 SY-TJ培养特征及其形态学Fig.2 Culture characteristics and morphology of SY-TJ

以最大似然法(ML)构建系统发育树，外群为C. pisicola。The phylogram was generated of ML analysis. The tree was rooted with C. pisicola.图3 基于部分ITS、GAPDH、CHS-1和ACT基因的序列Fig.3 Phylogram analysis based on combined ITS， GAPDH， CHS-1 and ACT sequences

SY-TJ可利用全部6种碳源；最适生长的碳源为淀粉，最不适宜的碳源为乳糖。12 d菌落直径见图4。

2.3.2 不同氮源对病原菌生长的影响

SY-TJ无法利用草氨酸(接种初始菌饼直径为0.7 cm)；最适生长的氮源为硝酸钠、蛋白胨和硝酸钾，最不适宜生长的氮源为草氨酸。12 d菌落直径见图5。

2.3.3 不同温度、pH、光照对病原菌生长的影响

SY-TJ的pH适应范围非常广，pH=3时菌丝不生长，其余均有生长，在pH=5时菌落直径最大。最适生长温度为25 ℃；40 ℃时，其菌丝不生长。光照对其菌落直径没有明显的影响，但黑暗条件会导致菌丝颜色变深，全光照条件下菌丝颜色为浅粉色，12 d菌落直径见图6。

2.4 拮抗菌筛选

将分离得到的67株链霉菌与SY-TJ进行了拮抗菌初筛，复筛表现良好的有4株，其中2株抑菌带超过1 cm，具有良好的生防潜力。F18和F35效果较好，抑菌带直径分别为1.1 cm和1.0 cm，F22为0.6 cm，F58为0.75 cm，F23为没有拮抗作用的菌株，CK为同期接种病原菌的生长情况(图7)。

不同处理间没有相同字母表示差异显著(PThe bars without the same letters showed the significant difference(P图4 不同碳源对菌落直径的影响Fig.4 Effect of different carbon sources on colony diameter

图5 不同氮源对菌落直径的影响Fig.5 Effect of different nitrogen sources on colony diameter

2.5 拮抗菌的生理生化鉴定和系统发育分析

系统发育分析见图8，生理生化指标见表2。通过生理生化鉴定和系统发育分析，初步将F18鉴定为白长链霉菌(Streptomycesalbolongus)，F35鉴定为抗铅链霉菌(Streptomycesplumbiresistens)[24]。

3 结论与讨论

本实验验证了病原SY-TJ的致病性，通过形态学和系统发育分析，将其鉴定为瓜类炭疽菌(C.orbiculare)。生物学特性结果显示：该菌可以利用的最佳碳源为淀粉，最佳氮源为硝酸钠、蛋白胨和硝酸钾，不能利用草氨酸。其最适宜生长温度为25～30 ℃。光照和pH值对其菌落直径影响不大，在pH 4～11时其均能生长。光照不影响其生长，但会影响其色素的形成。筛选得到2株具有良好拮抗效果的生防链霉菌菌株F18和F35。根据生理生化指标和系统发育分析，初步将F18鉴定为白长链霉菌(S.albolongus)，F35鉴定为抗铅链霉菌(S.plumbiresistens)。

图6 不同温度、pH、光照对菌落直径的影响Fig.6 Effect of different temperature， pH and illumination on colony diameter

图7 平板对峙试验结果Fig.7 Result of agar antagonistic tests

表2 2株链霉菌的生理生化指标

Table 2 Biochemical characterization of twoStreptomyceteisolates

指标IndexF35F18指标IndexF35F18精氨酸Arginine++棉子糖Raffinose++天冬氨酸Aspartic Acid++木糖Xylose-+鼠李糖Rhamnose++明胶Gelatin-+蔗糖Sucrose++纤维素分解Cellulose Decomposition++葡萄糖Glucose++淀粉水解Starch Hydrolysis-+阿拉伯糖The Arab Sugar++氧化酶Oxidase-+甘露醇Mannitol++过氧化氢酶Catalase++肌醇Inositol++硫化氢Hydrogen Sulfide-+果糖Fructose++黑色素Melanogenesis--

图8 基于2株拮抗链霉菌全部16SrRNA序列以最大似然法(ML)构建的系统发育树Fig.8 Phylogram generated of ML analysis based on whole 16SrRNA sequences of two antagonistic Streptomyces strain

最初烟草炭疽病病原曾有多个种的报道。分类学家曾在1922年和1932年按照寄主植物的类别分别将其命名为烟草炭疽菌(C.niocotianae和C.tabacum)，目前国外研究普遍认为烟草炭疽病的病原菌主要为毁灭炭疽菌(C.destructivum)。Shen等[9]发现瓜类炭疽菌(C.orbiculare)可致烟草属发病，后来逐渐被广泛承认。Wang等[25]报道了在中国贵州鉴定到烟草炭疽的新病原果生炭疽菌(C.fructicola)。苗圃[11]和柴欣等[26]报道贵州和河南的烟草炭疽病病原鉴定为胶胞炭疽菌(C.gloeosporioides)，柴欣等[26]的研究中烟草炭疽(C.niocotianae)与胶胞炭疽(C.gloeosporioides)聚合到一个进化分支。将以上致病种的序列与本研究分离到的SY-TJ菌株进行系统发育分析，验证它们之间的关系。系统发育分析结果显示(图3)，系统发育树形成了2个良好的进化分支，毁灭炭疽菌(C.destructivum)和烟草炭疽菌(C.tabacum)处在进化支1，胶胞炭疽菌(C.gloeosporioides)、果生炭疽菌(C.fructicola)和瓜类炭疽菌(C.orbiculare)处在进化支2，进化支内的菌株具有较近的亲缘关系。SY-TJ与瓜类炭疽菌(C.orbiculare)亲缘关系最近，处于同一个进化单系。

本实验筛选得到了2株在室内对烟草炭疽病病原菌具有良好拮抗作用的链霉菌菌株，有着潜在的生物学价值，可以结合大田试验来验证其是否对该病有着良好的生防效果；也可以对其次生代谢产物进行探究，以此开发新型的农药产品[19]。目前于国内并无瓜类炭疽菌(C.orbiculare)引起烟草炭疽病的报道，Shen等[9]的研究显示，瓜类炭疽菌(C.orbiculare)能引起烟草属植物炭疽病，瓜类炭疽菌(C.orbiculare)与毁灭炭疽(C.destructivum)是目前被广泛认可的两种烟草炭疽病原。本次研究从田间发现1株感染烟草炭疽病的病株，并且在实验室中对云烟87有一定程度的致病性(有伤接种)，说明该种有引起烟草炭疽病的潜力。该种对于烟草不同品种的致病性，以及该种引发烟草炭疽病是否具有普遍性尚需进一步田间调查来验证。