大通牦牛TLR2基因SNP位点筛选及生物信息学分析

彭 帅，陈 朗，郑天宇，陆会宁，张 丽，刘丽霞

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)作为动物机体重要的模式识别受体(pattern recognition receptors)，广泛存在于免疫细胞表面，如单核细胞、巨噬细胞等[1]，并且在上皮细胞、牛胚气管细胞等非免疫细胞中同样具有很强的活性[2]。自第一个Toll样受体于1997年被Medzhitov等[3]发现以来，迄今已有十余个家族成员[4]，它们通过识别病原体相关的分子模式(PAMPs)及某些内源性配体，引起信号转导并诱导特定的免疫效应分子释放(如炎症细胞因子)，是固有免疫防御中的重要分子，最终可激活适应性免疫应答[5]。TLR2属于TLRs家族成员之一，是一种具有识别病原相关分子模式和信号转导功能的跨膜受体蛋白，Mcguire等[6]将牛TLR2基因定位于17号染色体上。TLR2基因在机体中广泛分布，且在调控免疫机制方面具有重要作用，使其成为了牛抗病育种的候选基因之一。

TLR2具有较高的多态性，近年来，有关牛TLR2基因多态性及其与疾病的相关性研究已有大量报道。周峰等[7]研究发现，南阳黄牛TLR2基因相比荷斯坦牛发生了16个碱基突变。孙丽萍[8]研究表明，牛TLR2基因存在3个突变位点，且感染严重的乳区TLR2基因表达量明显增加。董慧敏[9]、叶小康[10]研究发现，病原微生物感染奶牛子宫后TLR2基因mRNA表达量明显增加，并分析了其与子宫内膜炎的关联性。Bhaladhare等[11]发现，牛TLR2基因存在3个SNP位点，并分析了其与结核病的相关性。杨永江等[12]发现，荷斯坦牛TLR2基因存在6个SNP位点。这些研究表明，牛TLR2基因具有高度多态性，并与许多免疫性疾病有密切关联，但有关大通牦牛TLR2基因的研究国内外还未见报道。

大通牦牛是分布于青海等地的特有品种，体格结实，体型相对紧密，肉用性能强，发育状况良好，因此引起了人们的广泛关注[13]。本实验以大通牦牛为研究对象，采用DNA混合池扩增后直接测序的方法对大通牦牛TLR2基因CDS区的SNP位点(单核苷酸多态性位点，single nucleotide polymorphism site)进行筛选分析，并对其进行生物信息学分析，为大通牦牛TLR2基因的深入研究和抗病育种提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 血样采集

大通牦牛血样采自青海大通牦牛种牛场，以随机抽样的方法，对55头大通牦牛进行颈静脉采集全血10 mL，加ACD抗凝剂抗凝，利用传统的苯酚-氯仿法抽提基因组DNA[14]。基因组DNA以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2 引物设计与合成

参照GenBank数据库中已发表的奶牛TLR2基因序列(登录号AF368419)和周峰等[7]已经设计好的TLR2基因特异性引物，分成五段进行扩增，预期扩增片段长度分别为522、822、574、526、599 bp。引物序列分别为：F1: 5′-GGACAATGCCACGTGCTT-3′，R1: 5′-GCACTGATCTCAAGCTCCTCAAG-3′；F2: 5′-TGAGGAGCTTGAGATCAGTG-3′，R2: 5′-ACTGTGTATCCTTGTGCTGG-3′；F3: 5′-CCTAGGTAATGTGGAGACG-3′，R3: 5′-AAGGAGGCATCTGGTAGAG-3′；F4: 5′-CCAGCACAAGGATACACAGT-3′，R4: 5′-CTTCATGTACCACAGTCCGT-3′；F5: 5′-TTCCTGTTGCTCCTGCTCAC-3′，R5: 5′-GACCACCACCAGACCAAGAC-3′。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 DNA混合池构建与PCR扩增

55个大通牦牛基因组DNA样品构建一个DNA混合池，以DNA混合池为模板进行扩增。PCR扩增体系为：DNA模板0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，2×PowerTaqPCR Master Mix (百泰克)11 μL，加ddH2O到20 μL。PCR反应过程：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火58.5 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 50 s，循环30次；最后延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 序列测定与分析

选择扩增效果良好的PCR产物直接送苏州金唯智生物科技有限公司进行纯化后双向测序。使用BioEdit[15]软件、MEGA6[16]软件对测序结果进行拼接，并筛选大通牦牛TLR2基因CDS区的SNP位点。

1.5 等位基因频率估算

利用MWSnap的度量尺测量大通牦牛TLR2基因各SNP位点峰图峰高，并估算各SNP位点等位基因频率，公式如下：

其中，HBC为等位基因B或C在SNP位点中的等位基因频率；B和C表示等位基因在SNP位点中的峰图峰高[17]。

1.6 生物信息学分析软件

大通牦牛TLR2基因mRNA二级结构使用在线程序RNA fold web server预测[18]；蛋白质二级结构预测网站为https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html[19]；蛋白质三级结构利用ExPASy的在线程序SWISS MODEL预测[20]。

2 结果与分析

2.1 大通牦牛TLR2基因PCR扩增结果

采用分段扩增方法，获得包含大通牦牛TLR2基因CDS区的5段基因片段。PCR产物以1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，引物特异性良好，PCR产物条带单一。5段基因片段大小为522、822、574、526、599 bp，电泳结果与预期片段大小吻合(图1)。

2.2 大通牦牛TLR2基因测序结果

利用MEGA6软件、BioEdit软件对测序结果进行拼接，并筛选SNP位点，结果表明，大通牦牛TLR2基因CDS区存在2个SNP位点(G677A、G1587A)，其中G677A位点导致半胱氨酸(Cys)转变为酪氨酸(Tyr)，G1587A位点未发生氨基酸突变(图2)。

2.3 SNP位点等位基因频率估算

图2 大通牦牛TLR2基因CDS区测序峰图及SNP位点Fig.2 Sequencing peak map and SNP locus of coding region of TLR2 gene in Datong yak

应用MWSnap软件的度量尺对各SNP位点峰图峰高进行测量，根据估算公式计算得G677A和G1587A位点等位基因频率分别为G(0.606)、A(0.394)和G(0.829)、A(0.171)，结果表明，G677A位点和G1587A位点都以等位基因G为优势等位基因(表1)。

2.4 大通牦牛TLR2基因mRNA二级结构预测与分析

运用在线程序(RNA fold web server 服务器)预测参考序列(登录号AF368419)和大通牦牛TLR2基因CDS区的两个SNP位点(G677A、G1587A)mRNA二级结构(图3)。对比参考序列mRNA二级结构，大通牦牛TLR2基因CDS区的两个SNP位点均导致mRNA二级结构发生改变，进一步造成mRNA二级结构自由能发生变化。参考序列mRNA二级结构自由能为-679.3 kcal·mol-1，G677A位点和G1587A位点mRNA二级结构自由能均有所增加，依次为-679.10、-677.60 kcal·mol-1。

2.5 大通牦牛TLR2蛋白二级结构预测分析

大通牦牛TLR2基因G677A位点为错义突变，突变前后蛋白质二级结构发生细微变化(图4)。预测结果显示，二级结构突变前：α-螺旋(h)占34.18%，β-折叠(e)占18.24%，无规则卷曲(c)占47.58%；二级结构突变后：α-螺旋(h)占35.71%，β-折叠(e)占16.84%，无规则卷曲(c)占47.45%。

2.6 大通牦牛TLR2蛋白三级结构预测分析

图3 TLR2基因CDS区各SNP位点突变前后mRNA二级结构对比Fig.3 Contrast of secondary structure of TLR2 gene before and after mutation of SNP sites in coding region

运用在线程序SWISS MODEL进行同源建模预测蛋白三维结构。结果显示，大通牦牛TLR2蛋白突变后三级结构发生细微变化，无规则卷曲和α-螺旋较多，与二级结构相符(图5)。

h，α-螺旋；e，β-折叠；t，β-转角；c，无规则卷曲。h， α-helix; e， β-folding; t， β-corner; c， Irregular crimping.图4 大通牦牛TLR2蛋白突变前后二级结构对比Fig.4 Comparison of secondary structure of TLR2 protein before and after mutation in Datong yak

图5 大通牦牛TLR2蛋白突变前后三级结构对比Fig.5 Comparison of tertiary structure of TLR2 protein before and after mutation in Datong yak

3 讨论

基因和环境的共同作用决定生物体的表型性状，基因的多样性决定生物体的基本免疫功能[21-22]。研究发现，TLR2基因作为固有免疫与适应性免疫之间的桥梁，在动物机体中占据着重要地位[23]。近年来，有关牛TLR2基因的研究主要集中在TLR2基因的结构和功能、多态性及其与疾病的相关性上。白杰等[24]研究发现，荷斯坦牛TLR2基因存在3个SNP位点。廖纯颖[25]研究表明，奶牛不活跃的乳腺成纤维细胞同样表达TLR2。林宝山等[26]利用荧光定量PCR，研究发现TLR2基因在牦牛小肠中有高表达现象。TLR2蛋白还能识别并结合牛肠中的微小隐孢子虫[27]。Lan等[28]研究发现，TLR2基因在牦牛脾脏中同样具有较高的表达。Yang等[29]研究表明，牛TLR2蛋白可通过NF-Κb途径诱导白细胞介素-1β的产生。Zhao等[30]发现，荷斯坦牛TLR2基因存在2个SNP位点，并分析了其与结核病的相关性。

DNA混合池扩增后直接测序是一种简单有效的SNP位点筛选方法[31]。单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism site，SNP)是指从基因组水平上对单个核苷酸突变位点进行研究和分析，对于研究基因的功能和指导抗病育种具有重要意义[32]。本研究采用DNA混合池扩增后直接测序的方法在大通牦牛TLR2基因CDS区筛选到2个SNP位点(G677A、G1587A)，其中G677A位点为错义突变，导致半胱氨酸(Cys)转变为酪氨酸(Tyr)，氨基酸的改变会导致TLR2蛋白的功能发生相应的变化。

CDS区核苷酸的改变可能会引起mRNA结构的改变，从而导致蛋白质的结构发生改变，进一步影响蛋白质的功能。大通牦牛TLR2基因mRNA二级结构预测结果显示，两个SNP位点mRNA二级结构均发生改变，自由能相比参考序列(登录号AF368419)均有所增加，导致mRNA二级结构的稳定性降低，可能会影响基因表达效率。大通牦牛TLR2蛋白二级结构中无规则卷曲占主导地位，G677A位点为错义突变，导致α-螺旋由34.18%增加至35.71%，β-折叠由18.24%降低至16.84%，无规则卷曲由47.58%降低至47.45%。由于无规则卷曲是构成配体受体结合的活性部位，G677A突变可能会对蛋白质二级结构的稳定性造成影响，从而影响蛋白质三级结构，使蛋白质功能发生变化。本研究对大通牦牛TLR2基因CDS区的多态性进行了分析，检测到一个错义突变的SNP位点，可作为筛选大通牦牛疾病遗传标记的理论基础。