尼罗罗非鱼Hsc70的原核表达和多克隆抗体制备

潘传燕，林 勇，冯鹏霏，张永德，罗洪林

(广西水产科学研究院 广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西 南宁 530021)

热休克同源蛋白Hsc70(heat shock cognate 70 ku protein)是热休克蛋白Hsp 70家族(heat shock proteins， Hsp70)的成员之一，也称Hsp73，是一种结合蛋白。Hsc70由两个结构域组成：一个结构域(N端)是相对分子质量为44 ku的三磷苷酶(ATPase)功能域，该区域高度保守，是ATP的结合位点；另一个结构域(C端)是一个25 ku的区域，该区域包含3个部分：多肽结合功能域、靠近C末端的可变区和C末端的基序。Hsc70和Hsp70具有高度的序列同源性(95%)和相似的生物化学特性。Hsc70在所有正常细胞内均能表达， 环境刺激(如细菌感染、高温等)后其表达量有不同程度的增加[1-2]。Hsc70存在于原核及真核生物细胞中，具有多种生物学功能：作为分子伴侣促进蛋白质折叠、定位、组装等[3]；参与免疫调节[4]；参与细胞的生命历程，如细胞分裂、分化和凋亡[5-7]；参与细胞抗氧化，有效保护细胞免受氧化及炎症反应带来的伤害[8]等。此外，王宇萍[9]指出：Hsc70的表达水平与HBV的复制呈正相关，Hsc70可能成为抗HBV的新型药物靶点。Hsc70 在不同组织中的表达量具有差异性，这一特点已经在斑马鱼、鲤鱼、黄颡鱼和虹鳟等鱼类中得到证实[2，10-12]。

罗非鱼具有多种优良的养殖性状，受到世界各国养殖户和消费者的青睐。我国是罗非鱼养殖大国，但细菌性疾病的暴发给我国罗非鱼产业造成了巨大的经济损失，并冲击了我国罗非鱼产业的发展。罗非鱼自身的抗应激能力是抵御细菌感染、应对环境胁迫的关键因素，决定了养殖成活率和养殖效益。Hsc70基因作为一种重要的看家基因，与生物体的抗逆抗应激能力密切相关， 影响机体的存活能力和生长速率[5]。目前，部分鱼类的Hsc70已被成功克隆，如黄颡鱼、大菱鲆、南方鲇、虹鳟、青鳉、松江鲈、岩原鲤等。张娟等[2]发现黄颡鱼Hsc70呈组成型表达，在多种组织中均有表达，但表达量有差异。高海霞[13]成功构建了松江鲈Hsc70的原核表达载体，并获得了其重组蛋白。研究表明，Hsc70受到高温、重金属、细菌感染等外界刺激时，会被诱导表达，维持内环境稳态[14-15]。关于尼罗罗非鱼Hsc70的原核表达和多抗制备还未见报道。因此，本研究利用无缝克隆技术构建尼罗罗非鱼Hsc70表达载体，分析其重组蛋白的表达情况，制备多克隆抗体，以期为进一步研究尼罗罗非鱼Hsc70的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

尼罗罗非鱼cDNA、质粒均为本实验室制备；蛋白原核表达载体pET-B2m(由pET-28a改造而来)和转化表达宿主菌B21均为武汉金开瑞生物工程有限公司产品；T4 DNA Ligase、DNA聚合酶、蛋白marker、限制性内切酶购自美国Fermentas公司；诱导剂IPTG购自德国默克公司，弗式完全佐剂、弗氏不完全佐剂是美国Sigma公司的产品；PVDF膜购自ThermoFisher公司；羊抗兔-HRP抗体购自美国Jackson公司；DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司(北京)；Ni-NTA亲和层析树脂购自GE Healthcare公司。

1.2 试验方法

1.2.1 抗原预测

采用在线分析工具ExPASy中的ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)预测Hsc70蛋白质疏水性，TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测Hsc70蛋白序列的跨膜区间。使用DNAstar软件预测Hsc70蛋白的亲水性、抗原指数等。采用Swiss-model在线分析软件(https：//swissmodel.expasy.org)对Hsc70蛋白进行三级结构建模。

1.2.2Hsc70基因扩增与原核表达质粒构建

根据尼罗罗非鱼Hsc70基因序列(NCBI登录号：XP 003455104.1)，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，上游引物序列为5′-TCCACTGGGTTCTCGGACTATGAGCAAAGGTCCGG-3′；下游引物序列为5′-TAAGGCCGCACTCGAGCACCACATCAACTTCTTCAATT-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性 45 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，共28个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测后进行切胶回收。

将PCR产物和载体用SalⅠ与BamHⅠ进行双酶切处理后，将目的片段与载体连接，构建重组质粒pET-B2m-Hsc70，转入大肠埃希菌B21；筛选含有Amp+的阳性克隆，提取质粒进行PCR扩增，电泳检测扩增产物后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定。

1.2.3 重组蛋白的原核表达及纯化

将重组质粒(pET-B2m-Hsc70)转化表达菌株B21，在含有Amp+(100 g·mL-1)的LB培养基上进行涂布，37 ℃振荡培养至D600为0.6，之后培养温度降至30 ℃；加入诱导剂IPTG至终浓度0.5 mmol·L-1，30 ℃诱导培养3 h。收集菌液，6 000g离心10 min收集菌体。用冰浴超声波破碎细菌，在4 ℃的低温条件下20 000g离心30 min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况和可溶性。

在Ni-NTA树脂层析柱中缓慢加入收集的诱导表达菌，流速为0.5 mL·min-1，收集穿柱液体。层析用 10倍柱床体积的NTA-0缓冲液冲洗，流速控制在1 mL·min-1左右，接着分别用10倍柱床体积的NTA-20、NTA-60、NTA-200、NTA-500缓冲液洗脱，控制流速约1 mL·min-1，收集各洗脱液，通过SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的纯度，紫外吸收法检测纯化蛋白的浓度。纯度达到要求的组分，于透析袋中4 ℃以1×PBS进行透析，最后于4 ℃超滤浓缩透析产物，用5 mL 8 mol·L-1的尿素溶液溶解目的蛋白。

1.2.4 多克隆抗体制备、效价检测

取2只日本大耳兔，耳静脉采血作为免疫前血清。纯化后的重组蛋白与等容积的弗氏完全佐剂混合，采用皮下多点注射法按每只500 μg的剂量免疫2只日本大耳白兔。每只兔子至少经过4次免疫，根据免疫效价，评估是否进行第5次、第6次的免疫，每次免疫中间隔14 d。免疫7 d后，耳静脉采血，用间接ELISA法检测血清中抗体的效价。

重组Hsc70蛋白(2 μg·mL-1)按每孔100 μL的量加入96孔板中进行抗原包被，4 ℃过夜；将待检血清按1∶2 000、1∶4 000作二倍梯度稀释至1∶32 768 000，稀释液作为一抗，各稀释梯度取100 μL至96孔板中，以免疫前血清作为阴性对照；HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗。每个反应孔用TMB显色液100 μL显色20 min，之后加入50 μL H2SO4终止反应。用酶标仪检测450 nm处的D值。出现阳性反应的最大稀释度即是待测样品的效价。

1.2.5 抗体纯化

采用Protein G亲和层析柱对Hsc70蛋白多克隆抗体进行纯化，详细操作步骤见张永德等[16]，将抗血清与2×PBS缓冲液等体积混合，经10倍柱体积以上的PBS洗涤，至流出液无蛋白检出，加入2倍柱体积0.1 mol·L-1柠檬酸(pH 2.7)洗脱，收集洗脱产物，纯化所得的抗体经SDS-PAGE电泳检测，-20 ℃保存备用。

1.2.6 Western blot检测

取25 ng和10 ng纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳后将其转移至PVDF膜，于封闭液中封闭2 h。加入制备的多克隆抗体(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h；洗涤后再用HRP标记的羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h后进行显色反应，取出拍照分析抗体的特异性。

2 结果与分析

2.1 抗原分析结果

根据蛋白的二级机构、B细胞表位、跨膜序列、疏水性等参数的分析(图1)，Swiss-model构建的Hsc70 3D模型见图2。结果显示，Hsc70基因编码蛋白由646个氨基酸组成，从重组蛋白表达来看，无跨膜区，无信号肽序列，亲水性好，抗原指数得分也适中，可以引起较好的免疫。

2.2 原核表达质粒的构建与鉴定结果

以重组质粒pET-B2m-Hsc70为模板，扩增Hsc70基因，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，获得一条1 938 bp的目的条带(图3)，与预期大小一致。测序结果显示：连接到载体中的目的序列与NCBI上的序列一致，且方向正确，确定Hsc70基因已正确插入载体pET-B2m中，表明重组质粒构建成功。

2.3 目的蛋白的表达与鉴定结果

对重组蛋白进行大量诱导表达，诱导条件为：

图1 尼罗罗非鱼Hsc70抗原表位分析Fig.1 Analysis of epitope of Hsc70 in Nile tilapia

图2 Hsc70三级结构建模Fig.2 Hsc70 tertiary structure modeling

M，DL2000；1，Hsc70。图3 Hsc70基因扩增结果Fig.3 PCR amplification of Hsc70

M，蛋白标准；1～2，其他蛋白；3，表达菌上清；4，表达菌沉淀。M， Marker；1～2， Other proteins; 3， The supernatant of expressed proteins；4， The precipitate of expressed proteins.图4 重组蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

诱导剂IPTG终浓度为0.5 mmol·L-1，诱导培养3 h后收集菌体进行SDS-PAGE电泳，结果如图4，上清液与沉淀均在75 ku处出现蛋白条带，且沉淀的蛋白条带较上清液粗，沉淀中的目的蛋白含量显著高于上清液(图4)，说明重组蛋白主要存在于沉淀中，目的蛋白主要以包涵体的形式存在。

2.4 重组蛋白纯化结果

重组Hsc70蛋白主要以包涵体的形式存在，利用Ni-NTA树脂层析柱纯化目的蛋白。纯化后的重组蛋白经10倍稀释后进行SDS-PAGE电泳，结果显示，在75 ku处有一条清晰的条带(图5)。纯化后重组蛋白的纯度达到90%，浓度为2 mg·mL-1，是适合免疫日本大耳兔的抗原。

M，蛋白标准；1，Hsc70。M， Marker；1， Hsc70.图5 重组蛋白纯化产物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein

2.5 多克隆抗体的效价测定

以免疫前血清作为阴性对照，免疫7 d后，耳静脉采血，用间接ELISA法检测多克隆抗体的效价。结果如图6，抗体的效价为 1∶2 048 000，说明该重组蛋白能诱导日本大耳兔产生良好的免疫反应。

图6 Hsc70多克隆抗体的ELISA曲线Fig.6 ELISA curves of Hsc70 polyclonal antibody

2.6 抗体纯化结果

收集的抗血清经Protein G亲和层析柱纯化后，通过SDS-PAGE电泳检测，结果显示，在约50 ku和25 ku处均出现一条清晰的蛋白条带(图7)。纯化后的抗体纯度大于85%，浓度为10 mg·mL-1，抗体纯化效果良好。

2.7 Western blot检测结果

纯化后的重组蛋白进行Western blot检测，结果见图8，25 ng和10 ng重组蛋白均在约75 ku处出现一条清晰蛋白条带，且25 ng蛋白条带较10 ng的蛋白条带粗，而免疫前血清对照组在相应位置无特异性条带，不存在特异性反应，表明Hsc70抗血清具有较高的特异性。

M，蛋白标准；1，Hsc70抗体。M， Marker; 1， Hsc70 polyclonal antibody.图7 Hsc70抗体纯化结果Fig.7 Analysis of purified products of Hsc70 polyclonal antibody

M，蛋白标准；1，10 ng Hsc70重组蛋白；2，25 ng Hsc70重组蛋白；3，阴性对照。M， Marker; 1， 10 ng Hsc70 recombinant protein; 2， 25 ng Hsc70 recombinant protein; 3， Negative control.图8 Western blot印迹分析多克隆抗体的特异性Fig.8 Specificity of polyclonal antibody by Western blot assays

3 讨论

Hsp70是热休克蛋白中最保守、最重要，也是研究最深入的蛋白质家族之一，能在各种外界刺激如温度胁迫、盐度胁迫、溶解氧胁迫、微生物感染等的诱导下表达。Hsc70是Hsp70家族的结构型蛋白成员之一，含有较多的内含子，具有管家基因的功能，研究发现，敲除小鼠体内的Hsc70基因，小鼠细胞无法存活[17]。在正常环境下，Hsc70为组成型表达[18]，受到外界刺激时为诱导表达，这一点已在部分鱼类得到验证，如病原感染能诱导大菱鲆Hsc70表达[19]，热刺激可诱导黄颡鱼Hsc70表达[2]。目前，已在多种生物中克隆出Hsc70，如近江牡蛎、草鱼、孔雀鱼、豆卜馍夜蛾、中华鳖、凡纳滨对虾等[4，20-24]。郑薇薇[25]首次克隆了棉铃虫Hsc70，并证实20-羟基蜕皮酮可诱导Hsc70入核表达。冯冰冰等[26]从缢蛏中获得了Hsc70亚家族基因并命名为ScHsc70，ScHsc70基因可能参与了对细菌感染的防御反应。章海滨等[5]克隆出岩原鲤Hsc70，其氨基酸序列与草鱼的有100%同源性，岩原鲤Hsc70基因的表达存在明显的组织差异性。Li等[27]报道，中国软壳海龟受热刺激后，Hsc70转录水平会迅速上调，其蛋白相对表达量增加数十倍。

多克隆抗体是用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，该动物机体所产生的抗体就是多克隆抗体，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。制备多克隆抗体过程较简单，直接用抗原免疫动物，经过3～4次免疫，ELISA检测效价，收集抗血清，纯化后即可得到多克隆抗体。制备高效价的抗体是检测基因表达和研究基因功能的重要前提[28]。多克隆抗体具有制备周期短、技术要求不高、稳定性较好、能识别多个表位、制备成本较低等优点，广泛使用于多个科研领域[29]，如常用于变性蛋白的检测，石蜡包埋组织切片的染色，相应抗原的标记，农药残留现场监测，病原物的检测、疾病的诊断及治疗等。多克隆抗体因制备较简单和用途广泛而在细菌、病毒、动植物等多种生物开展研究，通过制备多克隆抗体为进一步研究相关蛋白的功能做准备。洪伟鸣等[30]制备了单增李斯特菌溶血素(listeriolysiono，LLO)多克隆抗体；毕庄莉等[31]获得了效价高、特异性好的新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白的多克隆抗体；彭琪琪等[32]制备了一个植物半胱氨酸蛋白酶的多克隆抗体等。本研究利用大肠埃希菌原核表达系统成功表达尼罗罗非鱼Hsc70蛋白，通过纯化包涵体蛋白并免疫日本大耳兔获得了效价高、特异性强的多克隆抗体。

在制备抗体前对目的蛋白进行生物信息学分析，有利于提高抗体制备的成功率。Hsc70基因结构上高度保守，经生物信息学软件分析，编码646个氨基酸，无跨膜区，无信号肽序列，亲水性好，抗原表位较好，适合用于抗原抗体制备。本研究在对Hsc70进行生物信息学分析的基础上，表达全长蛋白进行多抗免疫，实验结果表明，全长表达的蛋白具有良好的免疫原性，获得的多克隆抗体，效价达1∶2 048 000，且能特异性的识别尼罗罗非鱼Hsc70蛋白。本研究获得的重组蛋白和多克隆抗体为Hsc70功能研究提供了物质基础。